Kísérleti megközelítés a carotis testekben a leptin jelzésének és a kontrollra gyakorolt hatásainak vizsgálatához
Összegzés
Vizsgálatunk a carotis testben (CB) a leptin jelátvitel hipoxiás szellőztetési válaszra (HVR) gyakorolt hatásaira összpontosít. "Funkcióvesztés" kísérleteket végeztünk a leptin HVR-re gyakorolt hatásának mérésére CB denerváció után és "funkciónyereség" kísérletekkel a HVR mérésére a leptin receptor CB-ben való túlzott expressziója után.
Absztrakt
Az adipocitákkal előállított hormon, a leptin, egy erős légzésstimulátor, amely fontos szerepet játszhat az elhízás légzési funkcióinak védelmében. A carotis testek (CB), a perifériás hipoxiás érzékenység kulcsfontosságú szervei, kifejezik a leptin receptor hosszú funkcionális izoformáját (LepR b), de a leptin szignalizáció szerepe a légzés szabályozásában nem teljesen ismert. Megvizsgáltuk a hipoxiás ventilációs választ (HVR) (1) C57BL/6J egerekben a kiindulási leptin infúzió előtt és után, valamint a CB denerváció után; (2) LepR b hiányos, túlsúlyos db/db egereknél a LepR b túlzott expressziójának kezdetén és után CB-ben. A C57BL/6J egerekben a leptinnel megnövekedett HVR és a leptin HVR-re gyakorolt hatása CB denervációval megszűnt. Db/db egerekben a lepRb expressziója CB-ben kiterjesztette a HVR-t. Ezért arra a következtetésre jutunk, hogy a CB-ben lévő leptin fokozza a hipoxiára adott válaszokat.
Bevezetés
Az adipocita termeli a leptin hormont, amely a hipotalamuszban hat, hogy elnyomja a táplálékfelvételt és növelje az anyagcserét. Az 1., 2. laboratóriumban és más, 3., 4. laboratóriumban végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a leptin növeli a hiperkapnici légzési választ (HVR), a leptin elhízási hipoventilációja megakadályozza az elhízás hiányát. Az elhízott személyek többségének azonban magas a plazma leptinszintje, és ellenálló képességet mutat az 5, 6, 7, 8 hormon metabolikus és légzőszervi hatásaival szemben. A leptinnel szembeni ellenállás multifaktoriális, de a vér-agy gát (BBB) leptinnel szembeni korlátozott permeabilitása fontos szerepet játszik. Javasoljuk, hogy a BBB alatt a leptin a perifériás hipoxiás érzékenység kulcsfontosságú szervében, a carotis testben (CB) védje az elhízott egyének légzését. A CB-k expresszálják a leptin receptor hosszú funkcionális izoformáját, a LepR b-t, de a CB szerepe a leptin lélegzőbb hatásaiban nem tisztázott megfelelően 9, 10 .
Módszerünk célja a CB-ben lévő leptin szignalizáció HVR-re gyakorolt hatásának vizsgálata volt. Indoklásunk az volt, hogy (a) spekulációs mentességeket hajtsunk végre a funkcionális kísérletek alól ép karotid testekkel és denervált carotis testekkel egerekben, majd HVR mérésekkel; b) Funkcionális kísérletek megerősítése db/db egereken LepR b nélkül, amelyek során a HVR-t a LepR b expressziójának kezdetén és után mértük kizárólag CB-ben. Technikáink előnye az volt, hogy alvás és ébrenlét alatt minden kísérletünket féktelen, esztétikátlan egereken végeztük. Korábbi kutatók vagy altatásban végezték kísérleteiket 9, vagy alvás közben nem mérték a leptin hatásait 10. Ezenkívül tanulmányunk az első, amely egyedülálló funkciógyarapodási módszert alkalmaz a fent leírt szelektív LepR-b expresszióval a CB-ben.
Széles összefüggésben megközelítésünk általánosítható a CB-ben expresszált más receptorokra és azok szerepére a hipoxiás érzékenységben. A nyomozók egy ligandumot injektálhatnak egy érdekes receptorba, és mérhetik a HVR-t a CB denervációjának kezdetén és után. Kiegészítő megközelítésként az érdeklődésre számot tartó recept túl expresszálható a CB mérésekben, és a HVR mérések a túlzott expresszió előtt és után is elvégezhetők a kéziratban leírt technológiánkkal.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Az összes kísérleti protokollt az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá (MO18M211).
JEGYZET: A leptin légzésre gyakorolt hatásának tanulmányozásához a leptint szubkután infundáltuk sovány C57BL/6J egerekbe egy ozmotikus pumpán keresztül, hogy növeljük a keringő leptin szintjét a túlsúlyos egereknél tapasztaltakhoz.
- Oszmotikus pumpák előkészítése
- Mérje meg az üres szivattyút a betöltött oldat nettó tömegének ellenőrzéséhez.
- Adjon leptint (5 mg/ml) az ozmotikus pumpához (1 L/h 3 napig). Töltse fel a szivattyút egy kis fecskendővel (1 ml). Töltés után zárja be a szivattyút a mellékelt, fenékre döntött, 27 nyomos töltőcsővel.
JEGYZET: A fecskendőnek és a hozzá csatlakoztatott csőnek légbuborékmentesen kell lennie. - Töltés után mérje meg újra a szivattyút, hogy ellenőrizze az oldat nettó tömegét.
- Helyezze a leptinpumpa szubkután a interscapularis területbe.
JEGYZET: Ha azonnal meg akarja kezdeni az infúziót, inkubálja az előretöltött szivattyút 37 ° C-on, 37 ° C-on legalább 4-6 órán át (lehetőleg egy éjszakán át).
2. Hypoxic Ventillatory Response (HVR)
3. Nyaki carotis denerváció vagy carotis sinus ideg disszekció (CSND)
JEGYZET: Kombinált műtéti és kémiai denervációt végeztünk egy hét különbséggel, mivel a műtéti denerváció önmagában nem szünteti meg a hipoxiás kemoreflexet.
4. A LepR b expressziója a CB-ben adenovirális vektorral (Ad-LepR b) vs kontroll (Ad-LacZ)
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
A leptin folyamatos infúziója szignifikánsan növelte a HVR-t a sovány C57BL/6J egerekben 0,23-ról 0,31 ml/perc/g/FiO2-re (P 2. ábra) 11. A CSND eltörölte a HVR leptin által kiváltott növekedését (2. ábra), míg a CSND HVR-re gyakorolt enyhítő hatását nem észlelték a színlelt műtéti csoportban a leptin infúziót követően.
A LepR b expresszió a LepR b-hiányos elhízott db/db egerek CB-jében a HVR szignifikáns növekedését indukálta, 0,05-ről 0,06 ml/perc/g/SpO2-re (3. ábra). A HVR nem változott azokban az állatokban, amelyeket az Ad-LacZ kontrollal CB-be transzfektáltunk.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Vizsgálatunk középpontjában a leptin szignalizáció lélegzőbb hatásainak vizsgálata állt a CB-ben. Számos protokollt fejlesztettek ki a leptin szerepének mechanisztikus értékelésére. Először a CB specifikus hozzájárulását az IHL-hez úgy vizsgálták, hogy gondosan számszerűsítették az IHL-t a hipoxiás expozíció első 2 percében. Másodszor, a CB jelentőségét a légzésszabályozás leptin által közvetített fel-szabályozásában két kiegészítő megközelítéssel vizsgálták. Alacsony leptinszintű sovány vad típusú egerekben a HVR-t a leptin elején és folyamatos infúziója után mértük; a kísérletet CB denerválás után megismételtük. LepR b-hiányos db/db egereknél a HVR-t a LepR b expressziójának kezdetén és után mértük a CB-ben.
Az egerek CSND-je technikailag megterhelő az állatok és CB-k kis mérete miatt. Állandóan sikeres megközelítést dolgoztunk ki, közel 100% -os túlélési rátával, szigorúan a protokollunknak megfelelően. Protokollunk ellenőrzött körülményei közé tartozik a hő-semleges környezet, a gondosan ellenőrzött érzéstelenítés és a standard steril mikrosebészeti technikák a glossopharyngealis ideg vizualizálásával, mint éber műtét utáni kezelés fájdalomcsillapítással. Tapasztalataink azt mutatják, hogy a műtéti denerváció önmagában nem szünteti meg a hipoxiás kemoreflexet. A második lépést, a kémiai denerválást, gondos posztoperatív kezelés követi a túlélés javítása érdekében.
Leginnovatívabb technikánk a szelektív gén-túlzott expresszió a CB-területen. Ezt a megközelítést még nem hajtották végre, mivel a CB-k mérete csak kicsi, és nem fejeződnek ki olyan specifikus meghajtók, amelyek lehetővé tennék egy adott sejttípus számára érdekes gén kifejeződését. Valójában az I. típusú CB-sejtek nagyon hasonlítanak a szimpatikus idegsejtekhez vagy a mellékvese medulla sejtjeihez, míg a II. Típusú sejtek hasonlóak a 20, 21 asztrocitákhoz. Kihasználtuk azokat a db/db egereket, amelyekből hiányzott a LepR b gén, az adenovírus szuszpenzió szinte kizárólag a CB területre történő felvitelének képességét, valamint a 37 ° C-on gyorsan megszilárduló Matrigel mátrix tulajdonságait. Újszerű megközelítésünk felhasználható a jövőben bármely tirozin-hidroxiláz-specifikus (I. típusú sejt) vagy GFAP-specifikus (II. Típusú sejt) kiütést expresszáló gén szerepének vizsgálatára CB-ben egész testes egerekkel válik.
Protokolljainknak számos korlátja van. Először 3% CO2-t használtunk az IHL meghatározásához, és továbbra is kérdés, hogy tulajdonítható-e az IHL aránya a hiperkapnikus válasznak. Ennek a korlátozásnak a kezelése érdekében a kutatók egyidejűleg mérhetik a hiperoxikus gáz 3% -os CO2-ellensúlyozására adott reakciókat, ami kikapcsolná a CB-t. Másodszor, a HVR-t nem tudja teljesen megszüntetni a CSND 22. Ez a jelenség a neuroplaszticitásnak tulajdonítható, amely különösen hangsúlyos az egereknél. Ezért fontos, hogy a CSND után a lehető leghamarabb tanulmányozzuk a HVR-t, és mindig használjunk színlelt műtéti kontrollt. Harmadszor, a CB génexpressziós megközelítésünkből hiányzott a sejttípus és szervspecifika. A molekuláris technikák a szelektívebb promóterek jövőbeni alkalmazásával segíthetnek ellensúlyozni ezt a korlátozást.
Összefoglalva, a fent leírt korlátozások ellenére protokolljaink megvizsgálhatják egyes CB-gének szerepét a hipoxiára adott fiziológiai válaszokban.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzőknek nincsenek ellentmondó érdekeik vagy kinyilatkoztatásaik.