Kvantitatív valós idejű PCA az iparban; News-Medical
Jogi nyilatkozat: Ez az oldal az oldal eredeti fordításának eredeti fordítása. Felhívjuk figyelmét, hogy mivel a fordításokat géppel generálják, nem minden fordítás lesz tökéletes. Ezt a weboldalt és weblapjait angol nyelven kívánják olvasni. A webhely és weboldalainak fordítása részben vagy egészben pontatlan és pontatlan lehet. Ezt a fordítást egy gyakorlat biztosítja.
Specifikus DNS-fragmensek amplifikálása
A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan módszer, amely a DNS replikációjának mechanizmusát használja a DNS egy adott részének amplifikálására. Ez magában foglalja a DNS-polimeráz alkalmazását, amely szabad DNS-szálakat hoz létre szabad nukleotidok felhasználásával.
Két rövid DNS-darab, úgynevezett primerek felhasználásával lehetséges a DNS-polimerázt a DNS meghatározott régióiba irányítani. Normál PCR-reakcióban vannak olyan reakcióciklusok, amelyek exponenciálisan amplifikálják a DNS-célpontot.
Hogyan méri a DNS-cél mennyiségét ?
Valós idejű vagy kvantitatív PCR (qPCR), fluoreszcens festéket használnak az amplifikáció megtalálásához, mivel az valós időben történik. Alacsony koncentráció esetén a fluoreszcencia jele nem érzékelhető a háttér felett. A szintek növekedésével a fluoreszcencia jel is növekszik. A fluoreszcencia jel detektálhatóságához szükséges ciklusok száma "Ct érték" néven ismert. A Ct értékeket ciklusszámként fejezzük ki, azaz ha 15 ciklusra van szükség a jel megtalálásához, akkor a Ct értéke 15. A nagyobb DNS mennyiség azt jelenti, hogy kevesebb időbe telik, amíg a fluoreszcencia jel létrejön a háttérzaj felett, ami viszont kevesebb ciklust vesz igénybe . Ezért a DNS magasabb koncentrációinak alacsonyabb a Ct értéke.
Ha a tesztminták mellett ismert DNS-koncentrációkat használnak, akkor a vizsgálati mintákban lévő DNS mennyisége mérhető. Ez a Ct értéke és a DNS-cél mennyisége közötti kapcsolat miatt lehetséges; az egy Ct (ciklus) érték szerinti különbség a DNS mennyiségének kettős különbségének felel meg. Ezért, ha ismert mennyiségű DNS Ct-értéke 15, és a vizsgálati minta Ct-értéke 14, akkor a vizsgálati minta kétszerese a DNS-nek.
Különböző fluoreszkáló festékek
Különböző típusú fluoreszkáló festékek használhatók a qPCR-ben; specifikus és nem specifikus színezékek. A nem specifikus színezékek, például a SYBR zöld, nemspecifikusan kötődnek a kettős szálú DNS-hez. A PCR-termék mennyiségének növekedésével ez több kettős szálú DNS-t eredményez, hogy a SYBR green kötődhessen. Ez azt jelenti egymás után, hogy van egy intenzívebb fluoreszkáló jel. A probléma azonban az, hogy bármilyen kettős szálú DNS-hez, például primerekhez képes kötődni, nemcsak a amplifikált célrészhez.