Lélegzetgyűjtés a gyermekektől a betegségért Biomarker Discovery Protocol (lefordítva németre)
Összegzés
Ez a protokoll egy egyszerű módszert ismertet a gyermekek légzésmintáinak megszerzésére. Röviden, a kevert levegő mintáit szorbenscsövekben előzetesen koncentráljuk a gázkromatográfia-tömegspektrometriás elemzés előtt. A fertőzéses és nem fertőző betegségek légzésbiomarkereit ezen leheletgyűjtési módszerrel lehet azonosítani.
Absztrakt
Bevezetés
A biomarkerek értékes információkat hordozhatnak a normális és kóros biológiai folyamatokról, amelyek hozzájárulhatnak a klinikailag azonosítható betegség kialakulásához. A közelmúltban egyre nagyobb az érdeklődés a légzési illékony anyagok biomarkerként történő értékelése iránt számos betegség állapotában, beleértve a fertőzéseket, az anyagcserezavarokat és a rákot 1. A kilélegzett levegő mennyiségileg meghatározható mennyiségben tartalmaz illékony szerves vegyületeket (VOC), félig illékony szerves vegyületeket és mikrobiálisan származó anyagokat (például baktériumokból és vírusokból származó nukleinsavakat). A kilélegzett levegő elemzésének központi célja a betegség állapotának és/vagy a környezeti hatásoknak az invazív betekintése. Számos módszer létezik a kilélegzett levegő összegyűjtésére és elemzésére, a kérdéses alkotóelemektől függően. Jelenleg nincs olyan standardizált kilégzett levegőmérési módszer, amely megnehezítené a vizsgálatok eredményeinek összehasonlító elemzését. A lélegzetgyűjtési eljárás egységesítése azért fontos, mert maga a mintavételi eljárás jelentős hatással van a lélegzet lefelé mutató eredményeire.
Számos tanulmányban késői légúti mintavételt alkalmaznak 2, 3. Ez a kiválasztás magában foglalja a kilélegzett levegő első részének ("holttér") eldobását annak érdekében, hogy a levegőt előnyösen megragadja a légzési ciklus végén. Ennek a stratégiának az az előnye, hogy minimalizálja az exogén VOC (pl. Ökológiai VOC) szintjét, miközben gazdagítja az endogén, betegspecifikus VOC-kat. Ez a módszer megakadályozza az egyén kilégzését az első néhány másodpercben, mielőtt összegyűjtötte a lélegzetmintát. Más kutatók nyomásérzékelővel aktiválták a mintavételt egy előre meghatározott 4, 5 fázissorrendben. Mivel a nyomásérzékelők komplex technológiát igényelnek, ehhez az alternatív módszerhez dedikált és viszonylag drága mintavevő berendezés szükséges.
A gyermekkori légzésmintavétel különösen nehéz lehet. Komoly aggodalomra ad okot, hogy a kisgyermekek esetleg nem tudnak rönkkel dolgozni az önkéntes "kilégzés" légi kilégzés céljából. Emiatt könnyebb a vegyes légúti légzést elérni a gyermekektől. A vegyes légúti leheletmintáknál azonban fontos korlátozás a környezeti és anyagszennyeződés kockázata. Ezért a gyermekgyógyászati gyűjtés megvalósíthatósága a helyszínen hajtó gondot jelent.
Az adatgyűjtési módszerek mellett a leheletminták visszatartása is befolyásolhatja a minta minőségét. A levegő magas páratartalma és az illékony szerves vegyületek ultra-alacsony koncentrációja (billiórészenként) miatt a leheletminták különösen hajlamosak a memóriával kapcsolatos problémákra 6, 7. A valós idejű technikák, például a protontranszfer-reakció-tömegspektrometria (PTR-MS) nagy lehetőségei ellenére a GC-MS továbbra is az aranystandard a leheletminták elemzésében. Mivel a lélegzetminták GC-MS elemzése offline technika, előkoncentrációs módszerekkel párosul, például termikus deszorpciós (TD) csövekkel, mikro-szilárd fázisú extrakcióval és tűfogó eszközökkel. A leheletmintákat előzetes koncentrálás előtt ideiglenesen 8 polimer zacskóban kell tárolni. A polimer táskák népszerűek mérsékelt ára, viszonylag jó tartóssága és újrafelhasználhatósága miatt. Míg a táskák újrafelhasználhatók, idő és erőfeszítés szükséges a hatékony tisztítás biztosításához 7,8. Minden egyes zsák empirikusan meghatározott és szabványosított eljárásokat is igényel a minőségellenőrzés, az újrafelhasználhatóság és a hasznosítás érdekében.
A TD-csöveket széles körben használják a lehelet előkoncentrálására, mivel nagy mennyiségű illékony anyagot ragadnak meg és testreszabhatók. A TD csövek csomagolásához használt abszorbens anyagok speciális alkalmazásokat és specifikus cél illékony anyagokat képesek befogadni. A TD-csövek jelentősen javítják a légzési biomarker-vizsgálatok kényelmét, különösen a távoli gyepeken, mert a TD-csövek legalább két hétig biztonságosan tárolják a légzési illékony anyagokat és könnyen szállíthatók 3 .
Annak érdekében, hogy egységesítsük a gyermeki lélegzetgyűjtést a biomarkerek felfedezéséhez, itt leírunk egy egyszerű módszert a gyermekek lélegzetének összegyűjtésére. A megvalósított protokollok reprezentatív eredményeinek szemléltetésére anonimizált adatokat mutatunk be egy folyamatban lévő (8-17 éves) gyermekek csoportjának az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) értékelésében. A tanulmány teljes eredményéről és elemzéséről egy későbbi publikáció számol be. Ennek során az adatok egy részhalmazáról számolunk be, hogy bemutassuk protokollunk alkalmazását. Röviden, a gyermekeket arra utasítják, hogy normál módon lélegezzenek ki a szájrészen keresztül egy polimer tasakba, mintha "lufit fújnának". Az eljárást 2-4 alkalommal megismételjük, amíg 1 liter lélegzet nem gyűlik össze. Ezután a mintát egy TD csőbe helyezzük és 5 ° C-on tároljuk a GC-MS elemzés előtt.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
A tanulmányt a Washington Egyetemi Orvostudományi Egyetem Intézményi Felülvizsgálati Testülete (# 201709030) hagyta jóvá. A beleegyezést a szülőtől vagy törvényes gondviselőtől szerezték a vizsgálatba való felvétel előtt. Fotók a 2. ábrán a szülők írásos beleegyezésével reprodukálva.
(3) Légzésátadás a termikus deszorpciós csövekbe
- A lélegzetvétel után azonnal gyűjtse a környezeti levegő mintáit a beteg köré.
- Helyezze a zsákot a szivattyú kimenetére tömlővel, amint az további 5. ábraLátható.
- Hajtsa le a szelepzsák szárát, hogy kinyissa a bemeneti egységet a mintavételhez.
- Rögzítse a nyitott szelepet a bemeneti szerelvény oldalán lévő recézett recézett csavar forgatásával az óramutató járásával megegyező irányba.
- Kapcsolja be a szivattyút, és járjon 100 ml/perc sebességgel 12 percig. A szivattyú 1200 ml környezeti levegőt fog gyűjteni.
- Miután a kívánt térfogat összegyűlt, lazítsa meg a bemeneti egység oldalán lévő recézett csavaros csavart az óramutató járásával ellentétes irányba forgatva, és tolja a szelep szárát, amíg a beömlő csatlakozás be nem fejeződik.
- Rögzítse a zsebszelepet az óramutató járásával megegyező irányba forgatva a beömlő szerelvény oldalán lévő recés hüvelykujj csavart.
- Válasszuk le a táskát a szivattyúról.
- Ugyanazok a lépések, mint a 3. szakaszban. Az egyetlen különbség az, hogy a környezeti levegőt, az illékony szerves vegyületeket viszik át, nem pedig a leheletet.
MEGJEGYZÉS: A lélegzet- és levegőminták elemzésének feltételeit a 9.
- Elemezze az összegyűjtött adatokat, és azonosítsa a vegyületeket a kromatogramokon. Használjon tipikus szoftverprogramokat a készülék által létrehozott összes kapcsolat megkeresésére és létrehozására (3A. Ábra)) elismert. Például dekonvolúciós funkció a vegyületek azonosítására. Szűrje az adatokat 80-as retenciós ablak-tényezővel, a tömegmagasság-szűrővel ≥100, és az összetett abszolút terület-szűrővel ≥ 500-szor.
- Használja a kémiai szabványokat a kilégzés és a levegő mintáinak azonosítására szolgáló vegyületekre. Bontsa ki a szóban forgó vegyületek, például izoprén és β-pinén bázision-csúcs területét (4. ábra)), és hasonlítsa össze a levegő és a levegő illékony szintjét.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Vizsgálatunk során 10 gyermek (8-17 éves) lélegzetmintáját értékelték jelenleg a St. Louis Gyermekkórházban. A lélegzet- és a környezeti levegő mintáit (n = 10) a fent leírtak szerint gyűjtöttük. A mintákat gázkromatográfia, quadrupole repülési idő szerinti tömegspektrometriával (GC-QToF-MS) és termikus deszorpcióval analizáltuk a fentiek szerint 9. A háttérszennyeződések eltávolítása után a megvalósított protokollok átlagosan 311 illékony szerves vegyületet (VOC) eredményeztek az egyes kevert kilégzett mintákban. Átlagosan lényegesen több VOC-t találtak a leheletmintákban a környezeti/környezeti kontrollokhoz képest (311 ± 11,5, szemben a 190 ± 12,6, p 3A ábra). A levegőben lévő VOC-k megnövekedett számát a környezeti levegőhöz képest egyértelműen reprezentatív teljes ion-kromatogramok (TIC) jelzik (3. ábra b) összehasonlítani.
A sikeres légvétel-minőség-ellenőrzés mértékeként két közös lehelet VOC (izoprén és β-pinén) szintje a Zimmer légszabályozókhoz képest (4. ábra)). Az izoprén, az egyik legelterjedtebb VOC a levegőben, általában milliomodrész (ppb) szintben (131 ppb), míg a β-pinene a ppb alatti szintekben (0,59 ppb) található 6. Mindkét vegyület egészséges felnőttek lélegzetében jön létre a beltéri levegő alacsony szintjéhez viszonyítva, ami azt jelzi, hogy a normál fiziológiai folyamatok dúsulnak, mint elsődleges forrás ezeknek az elemző anyagoknak a lélegzetben 6. Ekkor az izoprént (m/Z 67) 2,12 percig, a β-pinént (m/Z 93) 14,4 percig tartottuk. Megállapítottuk, hogy az izoprén gyermekek légzésmintáinak bősége tízszer nagyobb volt, mint a szobai levegő szabályozóiban (4. ábra; átlagos telítettség ± SEM 4,2x10 5 ± 1,0x10 5 és 3,9x10 4 ± 0,9x10 4 a levegő és a levegő esetében, p = 0,0003) és a β-pinene háromszor nagyobb telítettséggel rendelkezik a levegőben, mint a levegő A SEM értéke 3,0x10 4 ± 1,3x10 4, illetve 9,1x10 3 ± 1,6x10 3 a levegő és a levegő esetében, p = 0,007), megerősíti a sikeres légzésgyűjtést. A tanulmány Biomarker Discovery eredményeinek teljes leíró elemzéséről egy későbbi publikáció számol be.
1. kiegészítő ábra: Légzésmintavevő. Balra: (A) Légzésmintavevő összerakva: 1) dugós adapter + dugó (2) kétirányú gömbcsap + 3) teflon csatlakozó. (B) Karton szájrész. (C) kis és nagy átmérőjű tömlő. Jobbra: Lélegzetmintavétel szájcsővel és csövekkel. A fájl letöltéséhez kattintson ide.
Kiegészítő 2. ábra: Különböző légzési térfogatok. A fentieken egy gyűjtőzsák képei láthatók, amelyek különböző mennyiségű levegővel (1 L, 2 L és 2,5 L) vannak megtöltve, a hozzávetőlegesen összegyűjtendő légtérfogatok vizuális ábrázolásaként. A fájl letöltéséhez kattintson ide.
3. kiegészítő ábra: Szelep a zseben. Bal: a szelepszár lent van (a zsebszelep nyitva van). Rögzítse a zsebszelepet az óramutató járásával megegyező irányba forgatva a beömlő szerelvény oldalán lévő recés hüvelykujj csavart. A táska készen áll a lélegzetvételre. Jobbra: A szelep szára felül van (a szelepzseb zárt). A fájl letöltéséhez kattintson ide.
Kiegészítő 4. ábra: Lélegzetátadás. Balra: Szorbens cső (1) a zsák egyik végéhez van rögzítve kis és nagy átmérőjű csövekkel, a másik végén pedig a szivattyúhoz. Jobbra: Jegyezze fel a szorbenscső hornyos végét; a barázdált végnek a gyűjtőzsák felé kell mutatnia. A fájl letöltéséhez kattintson ide.
Kiegészítő 5. ábra: Környezeti levegő gyűjtése. Balra: Két csatlakozású szivattyú: be- és kimenet. A kimeneti nyílást egy gyűjtőtáska tartalmazza. A bemeneti nyílás beszívja a környezeti levegőt, és átviszi a zsákba. Jobbra: Környezeti levegő gyűjtő rendszer kiépítve. A fájl letöltéséhez kattintson ide.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Annak ellenére, hogy az elmúlt évtizedben jelentős előrelépés történt a légzéskutatás terén, az illékony leheletgáz mintavételére és elemzésére vonatkozó szabványosított eljárások továbbra is meghatározatlanok 10. A szabványosítás hiányának egyik fő oka a leheletadat-gyűjtési módszerek sokfélesége volt, amelyek közvetlen hatással vannak az adott kilégzett levegőminta kémiai sokféleségére. Az Atem exhalát illékony szerves vegyületek széles skáláját tartalmazza, nagyon különböző koncentrációkban 6. Ezért a felmérési módszerek megváltoztatása nemcsak a mintákban előforduló anyagok mennyiségét, hanem azok változatosságát is megváltoztatja.
A légzőgáz mintavétele meglepően bonyolult. Míg az alanyoknak az elemzés előtt ki kell lélegezniük egy kollektor szájrészébe vagy egy gázzáró tartályba, a légzésmintavétel során figyelembe kell venni és figyelembe kell venni számos lehetséges változót. Ebben a munkában egy speciális, validált protokollt mutatunk be a gyermekek légzésgázosítására. Eddig sikeresen megvalósítottuk ezt a protokollt lázas, 4 éves korú gyermekekkel, szántóföldi forgatókönyvben erőforrás-korlátozott környezetben (Malawi), napenergiával a légzésfelmérésünkben és a csővezetékek elemzésében a biomarkerek felfedezéséhez- 9. Ezután megvalósítottuk és kiértékeltük az értékelés alatt álló gyermekek légzésmintáinak gyűjtésére vonatkozó protokolljainkat az Egyesült Államok modern kiegészítő gyermekklinikáján. Eredményeink azt sugallják, hogy a gyermekkori lélegzet-biomarkerek azonosításához a kevert levegő összegyűjtése kritikus jelentőségű, mivel valódi "lenyomatot" ad az adott személytől. Ezenkívül a vegyes kilégzési légzés is a legegyszerűbb légzés, amely elérhető, mivel a kilégzett levegő (száj és orr) minden fázisa megszerezhető 3.
A terepen, és különösen akkor, ha az alanyok hevesen betegek, nehéz lehet ellenőrizni az olyan általános zavaró tényezőket, mint az étrend, a testhőmérséklet és/vagy a parfüm vagy krémek használata egy adott alanynál. Ezek a tényezők mély hatással lehetnek a légzés mennyiségére és minőségére. Ezért javasoljuk, hogy a vizsgálók ne csak rögzítsék a lélegzet befogásának és a szorbens csövekbe juttatásának idejét, hanem figyelembe vegyenek más betegspecifikus tényezőket is, mint például az étrend (pl. 24 órás étrend visszahívása), a szájvíz és a gyógyszeres kezelés, a biomarkerek felfedezése és a downstream elemzések során kifejezetten felmérni ezen potenciális zavarók hatásait.
A környezeti levegőből származó belélegzett vegyületek szintén befolyásolják a kilélegzett levegő összetételét, ami kihívást jelenthet a lélegzet biomarkerek felfedezésére irányuló erőfeszítésekre. A környezeti levegő elemzése és rögzítése ezért kritikus ellenőrzés, amely fontos ismereteket ad a kilélegzett illóanyagok eredetéről. Például a környezeti levegő illékony profiljait használták annak meghatározására, hogy egy adott lehelet nagyobb vagy alacsonyabb lélegzetvétel mellett illékony-e, mint a környező levegő 11. Egy adott leheletvegyület tehát a test belsejéből származik (pl. Endogén eredetű), ha a koncentráció nagyobb a leheletben, mint a levegőben, míg az alacsonyabb koncentráció a légzésben azt jelzi, hogy ez az anyag a környezetből származik (pl. exogén eredetű). A légzés illékony bőségének összehasonlítása a beltéri levegővel szintén fontos pozitív kontrollként szolgál a leheletgyűjtés megfelelőségére vonatkozóan. Mint reprezentatív adatainkban (4. ábra)) kimutatta, hogy az illékony izoprén vegyület endogén eredetű, és a levegő mintáiban a környező levegő 10-szereseinek nagyobb koncentrációban kell jelen lennie 6 .
A biomarkerek felfedezéséhez az érdeklődésre számot tartó emberek ingatag profilját össze kell hasonlítani az egyének egészséges egészséges kontrolljával, hogy statisztikai módszerekkel, például gépi tanulással és többváltozós elemzéssel azonosíthassuk a mintákat. Az itt leírt leheletgyűjtési módszer különféle kóros állapotokra alkalmazható; az egyetlen követelmény, hogy a gyermek önként jelentkezzen légzésmintavétellel. Mivel a lélegzetvizsgálat nem invazív, egyszerűen megismétlődik, és megegyezik a biológiai anyagok artériás koncentrációival, nagy ígérettel bír a klinikai felhasználásra szánt ellátáson alapuló tesztek végrehajtására.
A jövőbeni munka a fiatal csecsemők és gyermekek lélegzetvételének új módszereinek kidolgozására fog összpontosítani (előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t a könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzők nem árultak el semmit.
Köszönetnyilvánítás
Köszönetet mondunk a St. Louis Gyermekkórház gyermekeinek és családjainak, akik részt vettek ebben a tanulmányban. Elismerjük Stacy Postma asszony és Janet Sokolich asszony egyedülálló erőfeszítéseit a Breath Collection során. Ezt a munkát a St. Louis Gyermekkórház Alapítvány támogatja.