Mikrometasztázisok az őrszem nyirokcsomóiban a gyomorrákban - British Cancer Journal
Absztrakt
Fő
Anyagok és metódusok
Sebészeti minták és vérkészítés
Teljes méretű asztal
Összesen 11 reprezentatív nyirokcsomó, amely metasztatizált gyomorrákot tartalmaz, és az MKN-45, egy gyomorrákos sejtvonal, pozitív kontrollként szolgált, és öt olyan beteg nyirokcsomója, amelyek nem rákos megbetegedések miatt műtéten esnek át. Ezután 10 ml vért nátrium-citrátot tartalmazó csövekbe gyűjtöttünk, és sűrűséggradiens hipotóniás oldattal centrifugáltuk, majd a magban lévő sejteket összegyűjtöttük a vérben. Ezeket az öt egészséges donortól származó perifériás vér limfocitákat használtuk további negatív kontrollként.
RT-PCR és Southern blot teszt
Immunfestés
Valamennyi mintát 10% -os formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk és 4 μm-es sorozatokra vágtuk. A mintákat immunfestéssel vizsgáltuk a CK-18-ra az avidin-biotin-peroxidáz komplex módszerrel. Deparaffinizálás után a metszeteket 0,3% -os metanolos hidrogén-peroxiddal kezeltük 30 percig az endogén peroxidáz blokkolásához, és foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk. Ezután a mintákat normál kecskeszérummal inkubáltuk 30 percig a nem specifikus festés eltávolítása érdekében, és egy éjszakán át 4 ° C-on reagáltattuk 1: 100 arányban hígított anti-CK-18 monoklonális antitesttel. Kecske nyúl- és egér-peroxidáz jelzett (jelölt polimer reagens) immunglobulint (Dakopatts) 60 percig alkalmaztunk szekunder antitestként. Végül diaminobenzidint adtunk a színfejlődéshez, és metilzöldet alkalmaztunk a magfestéshez. A primer antitest helyett normális nyúl IgG-t használtunk a negatív kontrollhoz.
Mikrometasztázis
Ebben a vizsgálatban a mikrometasztázis olyan metasztázis volt, amelyet csak RT-PCR és Southern blot assay vagy immunfestés mutatott ki.
Eredmények
Tumor Marker mRNS expresszió a kontrollokban
A négy mRNS-marker, a CK-18, CEA, hTRT vagy MUC-1 egyike sem expresszálódott a negatív kontrollok egyikében sem, nevezetesen öt egészséges donor limfocitáiban és öt rák nélküli betegek nyirokcsomójában. A CK-18 a gyomorrák áttétet tartalmazó tizenegy nyirokcsomó közül nyolcban (73%), a CEA hétben (64%), a hTRT hatban (55%) és a MUC-1 expresszálódott hatban (55%). Más szavakkal, legalább egy mRNS marker expresszálódott az összes pozitív kontrollban. A CK-18 és a CEA képes volt MKN-45 sejtet kimutatni 106 limfocitában, 10 hTRT sejtben és 100 MUC-1100 sejtben (1. ábra).
Az RT-PCR érzékenysége és a gyomorrák mRNS markereinek Southern blot elemzése. 106 limfocitában az MKN-45 gyomorrák sejtvonal egyik sejtjét CK-18 és CEA, 10 sejtet hTRT és 100 sejtet MUC-1 mutatta ki.