MUNICH MŰSZAKI EGYETEM - PDF ingyenes letöltés
TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Klinikum és Poliklinika Traumatológiai Sebészeti Klinikum rechts der Isar Az MDR 2 knockout egér a máj osteodystrophia modelljeként Andrea Schmid A müncheni Műszaki Egyetem Orvostudományi Karán jóváhagyott disszertáció teljes példánya az orvosi doktori fokozat megszerzéséhez. Elnök: egyetem-prof. Dr. Rummeny E. J. Az értekezés vizsgálója: 1. apl. Prof. Dr. A. K. Nüssler, Tübingeni Eberhard-Karls Egyetem 2. Univ.-Prof. Dr. R. von Eisenhart-Rothe A disszertációt 2012. július 31-én nyújtották be a Müncheni Műszaki Egyetemnek, és az Orvostudományi Kar 2013. november 13-án fogadta el.
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék Rövidítések listája 1 Bevezetés 1 1.1 Általános bevezetés 1 1.2 Máj 1 1.2.1 A máj szövettani felépítése 1 1.2.2 A máj fiziológiai funkciói 2 1.2.3 A máj patofiziológiája 3 1.3 Csontok 4 1.3.1 A csontok szerkezete, a csontok szerkezete és a sejtek 4 1.3.2 A csont átalakulása és fiziológiai funkciói 5 1.3.3 A csontanyagcsere egyensúlyhiánya 6 1.4 Vizsgálati helyzet 7 1.4.1 Csontrendszeri változások krónikus májbetegségekben 7 1.4.2 A máj osteodystrophiájának reverzibilitása 8 1.5 D-vitamin anyagcsere 10 1.6 A TGF-β szerepe a májban és a csont anyagcseréje 11 1.7 Alternatív állatmodell 13 1.8 Kutatási kérdés 14 2 Anyag és módszerek 15 2.1 A vizsgálat felépítése 15 2.2 Vizsgálati állatok 16 2.2.1 Egér törzsek 16 2.2.2 A készítmény előkészítése 17
Tartalomjegyzék 2.2.2.1 Anyag 17 2.2.2.2 17. módszer 2.3 Hisztológia 18 2.3.1 Hisztotechnológia 18 2.3.1.1 Májszövetminták rögzítése 18 2.3.1.1.1 Anyag 18 2.3.1.1.2 Alapelv 18 2.3.1.1.3 A szövetrögzítés végrehajtása 18 2.3 .1.2 A májszövet-minták dehidrálása és beágyazása 18 2.3.1.2.1 Anyag és felszerelés 18 2.3.1.2.2 A dehidratáció és a beágyazás elve 19 2.3.1.2.3 A dehidráció és a beágyazás 19 2.3.1.3 Parafin-szakaszok előállítása 19 2.3. 1.3.1 Anyag és felszerelés 19 2.3.1.3.2 A szeletek elkészítésének elve 20 2.3.1.3.3. Eljárás 20 2.3.1.4 Hematoxilin-eozin festés és felszerelés 20 2.3.1.4.1 Anyag 20 2.3.1.4.2 A hematoxilin elve Eozinfestés 21 2.3.1.4.3 A festés elvégzése 21 2.3.1.5 Masson-Goldner trikróm festés és felszerelés 23 2.3.1.5.1 Anyag és felszerelés 23 2.3.1.5.2 A Masson-Goldner trichrom festés alapelve 24 2.3. 1.5.3 A festés elvégzése 24 2.3.2 A májszakaszok fénymikroszkópos értékelése Előkészületek 27 2.3.2.1 Eszközök és szoftverek 27 2.3.2.2 A fénymikroszkópos értékelés elve 27
Tartalomjegyzék 2.3.2.3 A fénymikroszkópos értékelés elvégzése 27 2.4 A vérszérum értékek meghatározása és értékelése 28 2.4.1 Az enzimaktivitás meghatározása 28 2.4.1.1 Anyag, berendezés és szoftver 28 2.4.1.2 Az enzimaktivitás meghatározásának elve 29 2.4.1.3 Az enzimaktivitás meghatározásának elvégzése 29 2.4.2 TGF-β -Koncentráció meghatározása 31 2.4.2.1 Anyagok, eszközök és szoftverek 31 2.4.2.2 Alapelv 32 2.4.2.3 A TGF-β koncentráció meghatározásának végrehajtása 32 2,5 Micro-CT mérések 35 2.5.1 Eszköz és szoftver 35 2.5.2 A μct mérés alapelve 35 2,5 .3 az µct mérés végrehajtása 35 2.5.4 A csont paramétereinek leírása 36 2.6 A génexpresszió számszerűsítése a májban és a csontszövetben 36 2.6.1 RNS izolálás a májban és a csontszövetben 36 2.6.1.1 Anyag, felszerelés és szoftver 36 2.6.1.2 Az RNS elve Izolálás 37 2.6.1.3 Az RNS izolálás elvégzése 38 2.6.2 Komplementer DNS (cdna) szintézis 40 2.6.2.1 Anyag és felszerelés 40 2.6.2.2 A cdna szintézis elve 40 2.6.2.3 Végrehajtás g cdna-szintézis 41 2.6.3 cdna-amplifikáció polimeráz láncreakció (PCR) és a DNS elektroforetikus elválasztásával 41 2.6.3.1 anyag, berendezés és szoftver 41
Tartalom 2.6.3.2 A PCR és a gélelektroforézis elve 42 2.6.3.3 A PCR és a gélelektroforézis elvégzése 43 2.6.3.4 Felhasznált primerek 44 2.6.4 A génexpresszió denzitometriai értékelése 46 2.6.4.1 Szoftver 46 2.6.4.2 A densitometriai értékelés elve és végrehajtása 46 2.7 Statisztikai adatok Értékelés 46 2.7.1 Szoftver 46 2.7.2 Statisztikai értékelés elvégzése 46 3 Eredmények 47 3.1 A májszövet szövettani értékelése az idő múlásával 47 3.2 Az MDR2 -/- egerek vérszérumában megnövekedett transzamináz- és dehidrogenázszintek 51 3.2.1 Enzimaktivitás LDH 51 3.2. 2 ASAT-enzimaktivitás 3.2.3 ALAT-enzimaktivitás 53 3.3 Csontfelépítés megváltozása MDR2 -/- egerekben 54 3.3.1 Kortikális csontépítészet 54 3.3.2 Rákos csontépítészet 56 3.4 Krónikusan megemelkedett TGF-β szérumszint MDR2-ben -/- egerek 60 3.5 Csontmarkerek csökkent expressziója idősebb MDR2 -/- egerek 61 3.5.1 OPN expresszió a májszövetben 62 3.5.2 Osteokalcin expresszió a májszövetben 63 3.5.3 OPG expresszió a májszövetben 64 3.5.4 OPN expresszió a csontszövetben 65 3.5.5 Osteocalcin expresszió a csontszövetben 66
Tartalomjegyzék 3.6 A D-vitamin metabolizmusát szabályozó enzimek és fehérjék májszövetének génexpressziója 67 4 Megbeszélés 69 4.1 Korlátozás és kilátások 77 5 Összefoglalás 80 6 Ábra lista 82 7 Táblázatok 83 8 Irodalomjegyzék 9 9 94. függelék 9.1 Festésoptimalizálás 94 9.1.1 HE festés 94 9.1.2 MGT Festés 95 9.2 További szövettani képek 96 9.3 További információk az alkalmazott primerekről 98 9.3.1 β-aktin 98 9.3.2 Osteokalcin 100 9.3.3 Osteopontin 105 9.3.4 Osteoprotegerin 107 9.3.5 MDR2 111 10 Köszönetnyilvánítás 117
Rövidítések listája 25 (OH) D 3 25-hidroxi-kolekalciferol 1,25 (OH) 2 D 3 1α, 25-dihidroxi-kolekalciferol PBC PBS PCR ph PSC PTH RANKL RNS RT RT-PCR sec SMI Taq TBE Tb.N Tb.Sp Tb.Th TGF -β TRAP TV ao UV V VDBP pl. primer biliaris cirrhosis foszfáttal pufferolt sóoldat polimeráz láncreakció pondus hydrogenii primer szklerotizáló cholangitis mellékpajzsmirigy hormon receptor aktivátor a nukleáris faktorhoz κ B ligás ribonukleinsav szobahőmérséklet fordított transzkriptáz polimeráz láncreakció második Struktúra modellindex Thermophilus aquaticus Tris-borát/EDTA trabecularis szám trabecularis szöveti rezisztencia-trabecularis szöveti rezisztencia β ideértve például az ultraibolya feszültségű D-vitamint kötő fehérjét
1 Bevezetés 13 1-5. Ábra A máj osteodystrophiájának hipotetikus szabályozási mechanizmusa TGF-β mint lehetséges szabályozó Grafikus források: http://www.servier.de/medicalart/skelett-und-knochen/?catselect=5; http://www.servier.de/medicalart/ arterien-physiologische /? catselect = 0; http://www.servier.de/medicalart/verdauungssystem/?catselect=7; 2011. augusztus 5. 1.7 Alternatív állatmodell Összességében véve nincsenek pontosan elvégzett hosszú távú vizsgálatok in vivo a máj osteopathia témájában. Ilyen esetben a betegpopuláció (a májbetegség típusa, időtartama, stádiuma; életkor, nem, társbetegségek)
2 Anyag és módszer 22 1. Roxlear I viaszmentesítése 3 perc Roticlear II Roticlear III 2 perc 2 perc Roticlear IV 2 perc Roticlear V 2 perc 2. Rehidratálás 99,9% EtOH I 3 perc 99,9% EtOH II 3 perc 99,9 % EtOH III 2 perc 90% EtOH 2 perc 80% EtOH 2 perc azaz 2 O 2 perc 3. festési hemalum oldat savas Mayer szerint 5 perc folyó csapvíz 15 perc eozin G oldat 0,5% vizes 3 perc azaz 2 O röviden 4. Dehidrálás 80% EtOH 30 sec 90% EtOH I 4 perc 90% EtOH II 4 perc 99,9% EtOH I 3 perc 99,9% EtOH II 5 perc 5. Tiszta Roticlear I 3 perc Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 min 5 perc 5 perc 3 perc 2-2. táblázat: Protokoll hematoxilin-eozin festés mp: másodperc A festés eredménye kék-ibolya sejtmag, halványvörös citoplazma, vörös izomrostok, vörös-narancssárga vörösvértestek és vörös kollagén kötőszövet (lásd 2-1. ábra) ).
2 Anyag és módszer 23 2-1. Ábra Példa máj, hematoxilin-eozin festésére, nőstény MDR2 -/- egér, élet hét 5 2.3.1.5 Masson-Goldner trikrom festés és felszerelés 2.3.1.5.1 Anyag és felszerelés Rotipuran 100% ecetsav ROTH (Kat. Sz .: 3738.4) EtOH 99,9%, 90%, 80%, 70% A hematoxilin oldat Weigert B hematoxilin oldat szerint Weigert Apotheke des MRI ROTH (katalógusszám: X906.1) ROTH (kat. Sz.) Világoszöld SF sárgás MERCK (Kat. Sz .: 115941) Narancssárga G MERCK (Kat. Sz .: 115925) Poncau Xylidine FLUKA Chemie GmbH (Kat. Sz .: 81465) Savas fukszin FLUKA Chemie GmbH (Kat. Sz.) Tungstofoszforsav-hidrát kristálytiszta legtisztább MERCK (katalógusszám: 100582) Roticlear ROTH (katalógusszám: A538) mágneses bottartomány mágneses keverő MR Hei-Mix L analitikai mérleg ROTH (kat. Szám: C267.1) Heidolph Instruments, D-Schwabach Kern és Son GmbH, D-Balingen
2 Anyag és módszerek 25 3. Savas fukcin ponceau-xilidinek 0,2 gramm (g) Ponceau-xilidinek 0,1 g savas fukcin 300 ml ddh 2 O 0,6 ml 1% ecetsav 4. Foszfotungstinsav narancs G 12 g volfrofoszforsav 3 g narancs G 200 ml ddh 2 O 5. világoszöld 0,3 g világoszöld SF sárgás 200 ml ddh 2 O 0,4 ml 1% ecetsav Az említett festést a színoptimalizálás során kidolgozott protokoll szerint hajtották végre (lásd az alábbi 9.1. Fejezetet) (lásd a 2-3. Táblázatot) . A festett, lecsepegtetett és megtisztított részeket ezután Roti-Histokitt II-vel fedtük le ugyanúgy, mint a HE-vel festett szakaszokat. A hematoxilin A és B Weigert szerinti keveréke szobahőmérsékleten legfeljebb 8 napig tartható. A festés eredménye fekete-barna sejtmag, vörös citoplazma, világos vörös izomrostok, narancsvörös vörösvértestek és zöld kollagén kötőszövet (lásd 2-2. Ábra). 2-2. Ábra Példa Masson-Goldner trichromot festő májra, nőstény MDR2 -/- egér, 44. hét
2 Anyag és módszer 26 1. Gyantázás Roticlear I 3 perc Roticlear II Roticlear III 2 perc 2 perc Roticlear IV 2 perc Roticlear V 2 perc 2. Rehidratálás 99,9% EtOH I 3 perc 99,9% EtOH II 3 perc 99,9 % EtOH III 2 perc 90% EtOH 2 perc 80% EtOH 2 perc 3. festés hematoxilin Weigert szerint 4 perc folyó csapvíz 10 perc savas fuchsin-Ponceau-xylidinek 2-4 perc 1% ecetsav rövid Foszfotungstinsav narancs G 5 perc 1% ecetsav rövid Világoszöld 15 perc 1% ecetsav 2 perc 4. Dehidratálás 80% EtOH 30 sec 90% EtOH I 4 perc 90% EtOH II 4 perc 99,9% EtOH I 3 perc 99,9% EtOH II 5 perc 5. Tiszta Roticlear I 3 perc Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 perc 5 perc 5 perc 3 perc 2-3. táblázat Protokoll Masson-Goldner trichromfestés
2 Anyagok és módszerek 28 Hematoxylin-Eosin Masson-Goldner Tri. I. stádium plusz 0 LRMCLRMC periductalis kötőszövet-lerakódások 1-3 ödéma 1 portális gyulladásos infiltrátum 1 II stádium plusz 5 epevezeték proliferáció 1 periportalis gyulladásos infiltrátum 1 portál-periportalis fibrózis 1-5 lepke által megevett nekrózis 1 III stádium plusz 13 epevezeték atrófia 1 mellkéreg nekrózis 1 -3 IV plusz 18 epevezeték ritkaság 1 Epeúti cirrhosis 1 Eredmény 2-4 táblázat A szövettani értékelés pontszáma 2.4 A vérszérum értékek meghatározása és értékelése 2.4.1 Az enzimaktivitás meghatározása 2.4.1.1 Anyagok, felszerelések és szoftverek Fluitest LDH-L tesztkészlet ANALYTICON Biotechnologies (katalógusszám: 2222) ) Fluitest GOT/ASAT ANALYTICON Biotechnologies (Cat-No .: 1176) Fluitest GPT/ALAT ANALYTICON Biotechnologies (Cat-No: 1186) LDH-Standard 0: NobiCalserum Multi Nobis/HITADO
de/min 2 Anyag és módszerek 31 percenkénti változás az abszorbanciában. Ezeket az átlagértékeket egy pontdiagramon ábrázoltuk az ordinátán az ismert enzimaktivitásokkal szemben az abszcisszán. Ezután kiszámolták a pontdiagram lineáris regressziós vonalát, valamint az azt leíró függvényt és annak determinációs együtthatóját. A 8. standard mért értéke megfelelt a vak értéknek. A számított függvény a következő formában állt rendelkezésre: Az x képlet megoldása után az egyes szérumminták 0 perc és x perc közötti időtartamát használtuk y-hez. Az így meghatározott x-értékek megfeleltek a vak értékre korrigált szérum minta enzimaktivitásának, és átkerültek a Microsoft Excel táblázatokba, statisztikailag kiértékelték a GraphPad Prism segítségével és grafikusan jelenítették meg. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0-0,05 Standard görbe LDH y = 0,0027x - 0,0213 R² = 0,9987 0 20 40 60 80 100 120 140 Enzimaktivitás [U/l] 2-3. Ábra Normál görbe példa Az LDH standard oldatok LDH fotometriai értékelése, beleértve a 3-7. Szabványokat 2.4.2 TGF-β koncentráció meghatározása 2.4.2.1 Anyag, berendezés és szoftver Rekombináns emberi TGF-β 1 peprotech Dulbecco s PBS (1) PAA Laboratories GmbH (katalógusszám: H15-002)
de/min 2 Anyag és módszerek 34 Az extinkció percenkénti növekedésének hozzárendelését egy adott TGF-β koncentrációhoz egy standard görbe segítségével végeztük el (lásd 2-4. ábra). Ebből a célból a standardonkénti átlagos értékeket az ismert TGF-β 1 koncentrációkhoz viszonyítva az abszcisszára az ordináta pontdiagramján ábrázoltuk. Kiszámítottuk a pontdiagram lineáris regressziós vonalát, valamint az azt leíró függvényt és annak determinációs együtthatóját, a 8. standardra mért érték a vak értéknek felel meg. A számított függvény a következő formában állt rendelkezésre: Standard görbe TGF-β 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,0033x + 0,0325 R² = 0,9803 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Koncentráció [ng/ml] 2-4. Ábra TGF-β standard görbe TGF-β standard oldatok fotometriai értékelése Az x képlet megoldása után az időtartam 0 perc x szérum minta x percig felhasználva. Az így meghatározott x-értékek megfeleltek a vak értékre korrigált szérum minta TGF-β-koncentrációinak, és átkerültek a Microsoft Excel táblákba, statisztikailag kiértékelték a GraphPad Prism segítségével és grafikusan jelenítették meg.
2 Anyag és módszerek 42 EtBr Glicerin SIGMA (Kat. Sz .: E1385-5ML) SIGMA (Kat. Sz .: G8773-500ML) peqgold Univerzális Agarose Peqlab (Kat. Sz .: 35-1020) puc19-marker ROTH (Kat- Sz .: X901.1) Taq-polimeráz 1000 U Axon Labortechnik (katalógusszám: 22466) Taq-polimeráz reakciópuffer 10 BD MgCL 2 dntp-keverék 10 mm per nukleotid Axon Labortechnik (katalógusszám: 24478) Tris (hidroxi-metil) ) aminometán Mastercycler ep gradiens PowerPac TM HC tápegység gél ix képalkotó SIGMA (katalógusszám: T87602-3KG) Eppendorf AG, D-Hamburg Bio-Rad Laboratories GmbH, D-München Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen Intas Steuer Képgyűjtő szoftver Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen 2.6.3.2 A PCR és a gélelektroforézis elve A PCR egy módszer arra, hogy in vitro a DNS egyes szakaszait szelektíven amplifikálni lehessen. Erre a célra a cdna-val töltött csövek és a reakcióelegy 40 cikluson keresztül futnak egy olyan eszközben, mint a Mastercycler ep gradiens. Minden ciklus 3 lépésből áll: 1. Denaturálás 95 ° C-on a DNS-szálak vagy primerek között meglévő hidrogénkötések megszakadnak, így csak egyetlen szál marad meg. Az inicializálás során ez a lépés 5 perccel meghosszabbodik, hogy a lehető legtöbb húr leváljon.