Növényi kivonatokból, mint lipáz inhibitorokból készült gyógyszerek - SCHREZENMEIER JUERGEN

1. A következő anyagok, anyagkivonatok vagy anyageszenciák alkalmazása egyedi komponensként vagy keverékként orálisan beadott gyógyszer előállításához, amely lipázinhibitorként működik:
Kardamom és/vagy
Majoránna és/vagy
Kakukkfű és/vagy
Chili (Capsicum frutescens) és/vagy
Esti kankalin és/vagy
Oregano levelek (oreganum vugare) és/vagy
Kamilla levelei (Chamomilla recutica) és/vagy
Szerecsendió (Myristica fragrans) és/vagy
Almaszósz (törköly) és/vagy
Gabonacsíra és/vagy
Mandula és/vagy
Mogyoró és/vagy
Dió és/vagy
Tökmag és/vagy
Cuphea wrightii és/vagy
Esti kankalin és/vagy
Olaj len (Linum usitatissimum) és/vagy
nagy bojtorján (Arctium lappa L) és/vagy
Len és/vagy
Helianthus annuus (napraforgó) és/vagy csírái
Körömvirág (Calendula officinalis) és/vagy
Echinops banaticus és/vagy
Mallotus philippinensis és/vagy
Repce és/vagy
Szezám és/vagy
fekete kömény és/vagy
Cynoglossum officinale és/vagy
Lapachotea és/vagy
Arctostaphylos uva-ursi és/vagy
Kővirág (Flor de piedra) és/vagy
Propolisz és/vagy
Primula Veris és/vagy
Magnolia officinalis és/vagy
Zeller (Apium graveolens)

mint

2. A következő anyagok, anyagkivonatok vagy anyageszenciák használata egyedi komponensként vagy keverékként
Kardamom és/vagy
Majoránna és/vagy
Kakukkfű és/vagy
Chili (Capsicum frutescens) és/vagy
Esti kankalin és/vagy
Oregano levelek (oreganum vugare) és/vagy
Kamilla levelei (Chamomilla recutica) és/vagy
Szerecsendió (Myristica fragrans) és/vagy
Almaszósz (törköly) és/vagy
Gabonacsíra és/vagy
Mandula és/vagy
Mogyoró és/vagy
Dió és/vagy
Tökmag és/vagy
Cuphea wrightii és/vagy
Esti kankalin és/vagy
Olaj len (Linum usitatissimum) és/vagy
nagy bojtorján (Arctium lappa L) és/vagy
Len és/vagy
Helianthus annuus (napraforgó) és/vagy csírái
Körömvirág (Calendula officinalis) és/vagy
Echinops banaticus és/vagy
Mallotus philippinensis és/vagy
Repce és/vagy
Szezám és/vagy
fekete kömény és/vagy
Cynoglossum officinale és/vagy
Lapachotea és/vagy
Arctostaphylos uva-ursi és/vagy
Kővirág (Flor de piedra) és/vagy
Propolisz és/vagy
Primula Veris és/vagy
Magnolia officinalis és/vagy
Zeller (Apium graveolens)
mint lipáz inhibitorok.

Ez szisztematikusan érhető el olyan aktív összetevőkkel, amelyek maguk felszívódnak vagy inaktiválódnak az emésztés során, és így a lipáz-kolipáz-zsír komplextel eltávolítják őket a reakció tömegéből.

A lipázinhibitorok beadása hasznos gyógyszeres kezelésnek tekinthető a metabolikus szindróma tüneteiben szenvedő betegeknél. Ezenkívül lipázgátló növényi kivonatot vagy az abból izolált komponenseket lehet használni élelmiszer-adalékanyagként.

A növényi kivonatoknak az emésztőrendszerben a lipáz lehetséges inhibitoraként való alkalmazását számos szabadalom említi. Ezek japán alkalmazások a következő számokkal: JP 2003 026 585, JP 2002 275 077, JP 2002 047 194 .

A növényi kivonatok pozitív hatásait az étkezés utáni lipidprofilra számos publikáció ismertette, nevezetesen a következő anyagokat, mint például a Zylokaria Paliurus, a szőlőmag, a zsálya, a Cassia mimosoides, a L. var. Nomame Makine és az Alpinia officinarum.

Ezenkívül a találmány azt a feladatot tűzte ki maga elé, hogy meghatározzon további növényeket, amelyek lipáz inhibitorokként használhatók.

A probléma megoldására a következő anyagok és ezek keverékeinek kivonatait vagy esszenciáit említik.
Kardamom
majoránna
kakukkfű
Chili (Capsicum frutescens)
Esti kankalin
Oregano levelek (oreganum vugare)
Kamilla levelei (Chamomilla recutica)
Szerecsendió (Myristica fragrans)
Almaszósz (törköly)
Gabonacsíra
mandula
mogyoró
dió
Tökmag
Cuphea wrightii (e)
Esti kankalin
Olaj len (Linum usitatissimum)
nagy bojtorján (Arctium lappa L) (e)
Len (e)
Helianthus annuus (napraforgó) csírái (e)
Körömvirág (Calendula officinalis) (e, h)
Echinops banaticus
Mallotus philippinensis (e)
Repce, e)
Szezám (ok)
fekete kömény (főnév)
Cynoglossum officinale
Lapachotea (e)
Arctostaphylos uva-ursi
Kővirág (flor de piedra)
Méhszurok
Primula Veris
Magnolia officinalis
Zeller (Apium graveolens)

A kivonatok elkészítésének leírása a) CO 2 kivonatok:

Nagynyomású extrakció szuperkritikus szén-dioxiddal. Nem tartalmaz vizet, cukrot vagy fehérjéket.

Kardamom:

  • A felhasznált növény része: az Elettaria cardamomum kapszulájú magjai.
  • Az alapanyagot Guatemalából szerezték be.
  • Kivonat állaga: olajos folyadék
  • A kivonat 72% illóolajat tartalmaz
  • Egyéb alkatrészek:
    α-pinén, β-pinén, β-mircén, 1,8 cineol, linalool, α-terpineol, linalil-acetát, terpinilacetát
Majoránna:
  • A felhasznált növény része: oregano majorana levelei
  • Kivonat állaga: olajos folyadék
  • A kivonat 80% illóolajat tartalmaz
  • Egyéb alkatrészek:
    Sabinen, cisz és transz Sabinenhidrate, Terpinen-4-ol, Sabinenhydratacetat
kakukkfű

A felhasznált növény része: a thymus vulgaris levelei. Az alapanyagot Németországból szerezték be. További információkért lásd fent a kardamomot.

A növényi kivonatokban lévő lipázt gátló anyagokat még nem azonosították.

A készítmény és az enzimaktivitások meghatározásának eljárása. A vizsgálati oldat elkészítése

A vizsgálati oldat kivont porból és folyékony anyagból történő előállításához 200 mg kivont anyagot feloldunk 1 ml megfelelő oldószerben, és erőteljesen keverjük. 5 percig 3400 fordulaton végzett centrifugálás után a kapott folyékony komponenst használjuk vizsgálati oldatként. A szilárd alkotórészek koncentrációja és az enzimtömeg arányának beállításához az utolsó kísérletben a vizsgálati oldatot 1: 200 arányban hígítottuk az alkalikus foszfatáz meghatározása céljából.

A vizsgálati oldat elkészítéséhez CO 2 kivonatokból és oleorezinkből 100 μl olajos folyékony kivonatot feloldunk 900 μl megfelelő enzimpufferben, és ultrahanggal kezeljük 100 watton 5 percig.

Hasnyálmirigy-lipáz (hasnyálmirigy-lipáz)

Két lipáz-meghatározást végeztek a hasnyálmirigy-lipáz aktivitásának in vitro meghatározására:

  • 1. A lipáz aktivitás meghatározásának vizsgálata a következőkből áll
    - 200 μl 50 mM/L BICIN puffer (pH 8,0), amely 1% technikai gumiarábikot tartalmaz.
    - 50 μl növényi kivonat-oldat és
    - 25 μl 0,35 mM/l hasnyálmirigy-lipáz oldatot

Ezt az elegyet 20 percig inkubáltuk 37 ° C-on.

A hasnyálmirigy-lipáz aktivitás végső mérését a klinikai kémia autoanalizátorában (Konelab, Kone) végezzük, lipáz-koloriméteres tesztet alkalmazva diacilglicerinnel, metil-resorufin-nal a harmadik helyen szubsztrátként, valamint a kolipáz- és epesókkal, mint esszenciális kofaktorokkal. Ez a folyamat specifikus a hasnyálmirigy-lipázra, és azon az enzimeken alapul, amelyek a metil-rezorufint hasítják le a szubsztrátból.

A következő pipettázási sémát választották a hasnyálmirigy-lipáz aktivitás meghatározásához az autoanalizátorban:

  • 1. 60 μl 1. reagens: kolipáz és kolát
  • 2. 2 μl vizsgálati oldat + 10 μl mosóoldat
  • 3. 180 másodperces inkubálás
  • 4. 40 μl 2. reagens: kolorimetrikus szubsztrát és kolát
  • 5. Inkubálás 120 másodpercig

A lipáz aktivitást 12 mérési pont alapján határoztuk meg 83 másodperc múlva. A metil-rezorufint fotometriásán mértük 75 nanométeren.

  • 2. A növényi kivonatok hatására bekövetkező lipázgátlást egy második lipázaktivitás-mérési módszerrel határoztuk meg, amelyben az enzim hidrolízise során mért szabad zsírsavak felszabadulását az enzim segítségével.
    Használatra kész oldatot (R1 reagenst) használunk az inkubációs keverék elkészítéséhez. R1 a következőkből áll:
    26 mmol/l Tris puffer, pH 9,2
    19 mmol/l nátrium-deoxikolát
    0,1 mmol/l kalcium-klorid
    0,3 mmol/l triolein
    300 KU/l kolipáz

Az inkubációs keverék a következőképpen áll össze:
50 μl 26 mmol/l Tris puffer, pH 9,2
50 μl 9,7 mmol/l triolein emulzió R1-ben
50 μl 0,134 mol/l hasnyálmirigy lipáz 26 mmol/l Tris pufferben, pH 9,2
50 μl vizsgálati oldat

1% metil-cellulózt 26 mmol/l Tris pufferben (pH 9,2) használtunk a CO 2 kivonatok vizsgálatához.

30 perc inkubálás után 37 ° C-on vízfürdőben a reakciót 3 ml kloroform-heptán-metanol (50: 49: 1) elegy hozzáadásával leállítottuk. A felszabadult szabad zsírsavakat 10 percig tartó erőteljes keverés közben extraháltuk a reakcióelegyből. Centrifugálás után (3400 fordulat, 10 perc) 2 ml maradékot kapunk a kloroformos fázisból és 1 ml rézreagensből (94 ml tiszta víz, 6 ​​ml 1 N NaOH, 6,45 mmol/L per Cu (NO 3) 2, 0,1 mol/l trietanol-amint, 33% (w/v) NaCl-ot adunk hozzá. Ezt az elegyet erőteljesen keverjük 10 percig, majd 10 percig 3400 fordulatnál centrifugáljuk. A felülúszó folyadékból 1 ml-t eltávolítottunk, és 1 ml kloroformot 0,1% -os fürdőkuproinnal és 0,05 (w/v) 3-terc-butil-4-hidroxi-anizolt adtunk hozzá. A zsírsav-réz-fürdőkuproin komplexet végül fotometriásan meghatározzuk 480 nm-en, standard fotométerrel.

Annak biztosítása érdekében, hogy a lipázaktivitás csökkenése ne egy nem specifikus enzim inhibitor vagy az enzim komplex denaturációja miatt következzen be, meghatároztuk az a-amiláz és az alkalikus foszfatáz aktivitását is. Az α-amiláz gátlása csökkentheti az étkezés utáni vércukorszintet, és további pozitív hatásnak tekinthető a cukorbetegeknél.

Az amiláz aktivitás mérését a növényi kivonatok hatása alatt a következőképpen hajtottuk végre:
Az amiláz aktivitás meghatározására szolgáló inkubációs keverék összesen 250 μL-t tartalmaz:

  • - 200 μl 50 mM/L MOPSO puffer (pH 8,0) 1% arábium gumival
  • - 25 μL növényi kivonat-oldat és
  • - 25 μl 0,35 mM/L α-amiláz oldatot

Ezt az elegyet 20 percig inkubáltuk 38 ° C-on. A hasnyálmirigy-lipáz aktivitás végső mérését egy kémiai kémiai autoanalizátorban (Konelab, Kone) végzik.

A kémiai reakció elve:

  • 1. Etilén-p-nitrofenol- (glükóz) 7 → etilén- (glükóz) 3-4 + ρ-nitrofenol- (glükóz) 2–4
  • 2. ρ-nitrofenol (glükóz) maradékok → ρ-nitrofenol (λ = 405 nm) + glükóz

Az a-amiláz aktivitások meghatározásához az auto analizátorban végzett pipetta eljárást a következőképpen hajtottuk végre:

  • 1. 120 μL reagens: szubsztrát + α-glükozidáz
  • 2. 300 másodperces inkubálás
  • 3. 3 μL vizsgálati oldat
  • 4. 180 másodperces inkubálás

Az a-amiláz aktivitást 5 pont 120 másodperc alatt történő mérésével határozzuk meg.

A lúgos foszfatáz aktivitás mérését növényi kivonatok hatása alatt a következőképpen hajtottuk végre:
A lipáz aktivitás meghatározására szolgáló inkubációs keverék a következőkből állt:

  • - 200 μl 50 mM/L HEDTA puffert tartalmaz (pH 8,0),
  • - 25 μL növényi kivonat vizsgálati oldat és
  • - 25 μl 0,014 mM/L alkáli-foszfatáz-oldat

Az elegyet 20 percig inkubáltuk 22 ° C-on.

A hasnyálmirigy lipáz aktivitásának végső mérését a klinikai kémia autoanalizátorában (Konelab, Kone) végeztük el.

Reakcióegyenlet

  • 2-amino-2-metil-1-propanol + 4-nitrofenil-foszfát-észter → (2-amino-2-metil-1-propanoö) -foszfát + 4-nitrofenoxid (λ = 409 nm)

Az alkalikus foszfatáz aktivitásának meghatározásához az autoanalizátorban végzett pipetta eljárás a következő volt:

  • 1. 150 μL reagens
  • 2. 300 mp inkubáció
  • 3. 3μL tesztoldat
  • 4. Inkubálás 120 másodpercig

Az alkalikus foszfatáz aktivitását 5 mérési pont alkalmazásával, 22 másodperc alatt határoztuk meg.

Eredmények% enzimgátlás enzimatikus tesztekben: