Őssejt-transzplantáció a CRISPRCas9 alapú ugróképzéshez a Xenopus Protokollban

Összegzés

A túléléshez elengedhetetlen gének technikai akadályokat rejtenek a mutáns törzsek létrehozásában. A Leapfrog megkerüli a letalitást azáltal, hogy a genomszerkesztést az őssejtsejt-transzplantációval ötvözi, és vadon élő állatokat hoz létre, amelyek csíravonal mutációkat hordoznak. A lépések elégetése lehetővé teszi a homozigóta nullmutánsok hatékony generálását az 1F generációban. Itt bemutatjuk a transzplantációs lépést.

Absztrakt

Bevezetés

Várhatóan Bond felgyorsítja a genetikai megközelítést a Xenopusnál. A Burn Steps alternatívát nyújt az anyai hatás gének LOF elemzésére szolgáló „gazdaszervezet transzfer” 22 módszerrel (publikálatlan). Ebben a kiadványban a módszer részletes leírását, a PGC-k transzplantációjára összpontosítva, az X. tropicalis (kisebb módosításokkal X. laevis esetében) ismerteti. A PGC transzplantációt itt mutatjuk be, hogy megkönnyítsük ennek a technológiának a gyorsabb átadását a Xenopusszal együttműködő más laboratóriumokba. Ennek a módszernek az alapelveinek sikeresnek kell lenniük más kétéltűeknél (pl. Urodeles), és a módszertan organizmus-specifikus módosításainak lehetővé kell tenniük sok más olyan állat alkalmazását, amelyek hatékony mutagenezise megvalósítható és a PGC könnyen átültethető.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az itt leírt módszereket a Kaliforniai Egyetem Irvine és az Intézményi Állattartás Tervezési Bizottsága hagyta jóvá.

1. A PGC transzplantációra szánt készítmények

250 ug sgRNS; Nézd Vita) 24. 10-20 percig az injekció beadásának helyén történő meggyógyulás után vigye át az embriókat egy agarózzal borított edénybe, amely 1/9 x MMR-t tartalmaz, és inkubálja 25 ° C-on. Hozzon létre egy nem iker embriókból álló edényt is, amely transzplantátum befogadóként szolgál. Készítsen elő Petri-csészéket (60 mm), amelyek tartalmazzák a

5 mm vastag 1% agarózréteg 0,3 x MMR-ben, ha szervátültetést végeznek X. tropicalis-ban, vagy 1 x MMR X. laevis esetén.

3-4 mm mélyen egy 3 x 4 lyukú (96 lyukú PCR lemez vágásával létrehozott) öntőforma behelyezésével az olvadt agarózba a lemezek öntésekor (lásd 1. ábra) és D). Tartsa az öntőformát néhány milliméterrel a Petri-csésze alja felett egy fogóval, amelyek egy gyűrűtartóra vannak rögzítve, amíg az agaróz megkeményedik.

Készítsen egy 24 üreges, egycsaládos embriólemezt úgy, hogy a lyukakat vékony 1% -os agarózréteggel vonja be 1/9 x MMR-ben.
Megjegyzés: Az ezekhez a mélyedésekhez hozzáadott táptalaj 1/9 x MMR, kiegészítve 50 µg gentamicin-szulfáttal/ml.

2. PGC transzplantáció

3. gyógyulás után az embrió gondozása

MEGJEGYZÉS: A graftok a helyükön belül gyógyulnak meg

30 perc, és normális, ha megfigyelünk néhány sárgasejt-lízis törmeléket az embrióból (3. ábra)).

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A transzplantáció után a CRISPR/Cas9 mutagenezis hatékonyságának minőségi meghatározását el kell végezni, mielőtt bármilyen tenyésztési erőfeszítést megtenne az állatok nemi érésig tartó fejlesztése és fenntartása érdekében. Mivel az ugrósejtes transzplantátumokat hordozó állatok szomatikusan vad típusúak, és a csíravonal közvetlen mérésekhez nehezen hozzáférhető, fontossá válik a donorembriók tetemének megmentése. A hasított test DNS-analízise a csírasejt-transzplantátum befogadóiban előforduló mutagenezis mérésére szolgál 17 .

Hasonló eredményeket értünk el 17 F0 kereszteződő állatból, amelyek mutációkat hordoztak a goosecoid gén (CGC) homeotikus dobozában (a DNS-kötő homeodomént kódolva) (lásd: 4a. Ábra, C-H). A CGC-expresszió hiánya antiszensz morfolino-oligonukleotidokkal X. laevis-ben azt sugallja, hogy a CGC-génre van szükség a 32 elülső fej teljes kifejlődéséhez, és a Cas9-sgRNS-vel injektált ebihalak 17-es embrionális letális fenotípusokat is látnak. A szomatikusan vad típusú 0 F ugrótömegű állatok életképesek és robusztusak, és az 1 F keresztezéssel létrehozott embriók LOF fenotípusokkal megegyeznek az X. laevis foldban publikáltakkal 17. Ezek az adatok a morfolino fenotípus genetikai megerősítését, valamint annak az elvnek a bizonyítását, hogy az ugrási szakaszok legyőzik az embrionális letális fenotípusokat.

1. ábra: A transzplantációhoz szükséges anyagok. Boroszilikát üveg (NÁL NÉL) A Pasteur pipettákkal szemöldökszőr kést és hajhurkot állítanak elő a korai stádiumú embriók mikrokirurgiájához. Az üvegre rajzolás Bunsen-égővel keskenyebb véget biztosít a haj behelyezéséhez. A piros nyíl azt a hozzávetőleges helyzetet jelzi, ahol az üvegnek el kell törnie. () példa szemöldökhajkésre (felső) és hajgöndörítésre (alul), gyorsan száradó ragasztóval pipettázunk. (VS), egy 96 üregű PCR lemez egy részét használjuk az agaróz géllemez mélyedéseinek kialakításához azáltal, hogy hagyjuk az 1% agarózt megszilárdulni a penész körül (0,3 x 1 x MMR-nél készített agaróz, annak megfelelően, hogy a szervátültetést X. tropicalis vagy X. laevis). Az agaróz vastagsága

5 mm, 3-4 mm mély kutakkal. (D) egy példa egy átültetett agaróz géllemezre, 12 mélyedéssel, a táblázat szerint VS. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.