Sejtdifferenciálás - emberek - táplálkozás - környezet
A kolorimetriás detektálás elve p-nitrofenollal A pNPP metabolizmusa sárga p-nitrofenollá az élő sejtek membránhoz kötött lúgos foszfatázai révén.
A p-nitrofenol-foszfát vizsgálatot (pNPP assay) először Engvall és munkatársai alkalmazták. (1980), és a tapadó és a nem tapadó sejtek közötti differenciálás mértékének meghatározására szolgál. A pNPP egy alkalikus foszfatáz (AP) szubsztrát. A foszfátmaradékok foszfatáz általi hidrolízise után a p-nitrofenol sárga, oldható végtermékként képződik. A reakció nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával történő befejezése után a szín intenzitása kolorimetriásan meghatározható az ELISA leolvasóban 405 nm hullámhosszon. A sárga termék képződése arányos az alkalikus foszfatáz aktivitásával.
Bal felső kép.
A fluorometriai detektálás elve fluoreszcein-difoszfáttal (FDP)
Az alkalikus foszfatáz aktivitása fluorimetriásan is meghatározható a differenciálódás mértékének értékelésére szolgáló mérőszámként.
Ebben az esetben a fluorimetrikus festék fluoreszcein-difoszfátot használjuk a kolorimetrikus p-NPP festék helyett. Az alkáli-foszfatáz képes fluoreszceint felszabadítani ebből a vegyületből, amelyet aztán fluorimetriásan mérhetünk (Ex 485nm/Em 538nm) a többlemezes leolvasóban.
Próbaértékelés
1. A minta fehérjetartalmának meghatározása Bradford-esszével
2. Mérje meg a minták abszorbanciáját vagy fluoreszcenciáját
3. Számítás: µM p-NP vagy fluoreszcein/perc/mg fehérje
Ábra jobbra fent.
Költségek (kolorimetrikus)
Költségek (fluorometrikus)
Alkalmazási példák
A differenciálódási események szabályozásának vizsgálata a sejtek és szövetek homeosztázisának összefüggésében a flavonoidok vagy oligoszacharidok kiegészítése után (Kuntz et al. 2007 és 1999)