Sejtmentes fehérjeszintézis
A genomkutatás az utóbbi években számos faj különböző génjének azonosításához vezetett. E génszekvenciák túlnyomó részére azonban jelenleg nem rendelhető hozzá meghatározott funkció, mivel a kódolt fehérjék csak a szokásos sejtalapú expressziós módszerekkel reprezentálhatók elégtelenül vagy egyáltalán nem. A funkció egyértelmű hozzárendelésének és validálásának alapvető előfeltétele a helyesen szintetizált és feldolgozott fehérjék elérhetősége. Ennek eredményeként egyre nagyobb szükség van olyan hatékony fehérjeszintézis-rendszerekre, amelyek képesek a legváltozatosabb szerkezeti és funkcionális osztályú fehérjéket egyformán, magas minőségben és mennyiségben előállítani. Ebben az összefüggésben a sejtmentes fehérjeszintézis módszerét jelenleg egyre gyakrabban használják, mivel ez lehetővé teszi a DNS-től a fehérjéig szükséges munkalépések hatalmas felgyorsítását. Ezenkívül a sejtmentes fehérjék új tulajdonságokat kaphatnak, amelyek döntő fontosságúak a további technológiai alkalmazások szempontjából.
A technológia fejlesztésének kezdetei
Jelenlegi in vitro transzlációs rendszerek
A sejtszerű fehérjeszintézis területén végzett intenzív kutatás a rendszer fejlesztése során arra vezetett, hogy meghatározták a prokarióta és eukarióta in vitro transzlációs rendszerek korlátait és optimalizálták az alapvető paramétereket. Azok a kutatási területek, amelyeken jelenleg intenzíven dolgoznak, különösen a transzlációban aktív sejtlizátumok továbbfejlesztése rendkívül produktív rendszerekké, a különféle sejtmentes rendszerek speciális DNS- és RNS-mátrixainak előállítása és optimalizálása, valamint az új fejlesztésű reaktorrendszerek reakciókontrolljának javítása.
A sejtmentes fehérjeszintézis lehetőségeit az eukarióta in vitro transzlációs rendszerek jelentősen kibővítik, mivel a poszttranszlációs módosítások befolyásolják a fehérjék fizikai-kémiai tulajdonságait, és funkcionalitásuk szempontjából gyakran alapvető fontosságúak. A sejtmentes fehérjeszintézis döntő előnyei, mint például a tartósan aktív vagy citotoxikus membránfehérjék nagy teljesítményű szintézise, most már kombinálhatók biochip alapú, impedimetrikus és elektrofiziológiai funkcionális elemzésekkel.
A sejtmentes fehérjeszintézis egyik alapvető előnye, hogy lineáris DNS templátokat adagolhatunk közvetlenül a nyílt rendszerbe, és a kódolt genetikai információt fehérjékbe írhatjuk át időigényes klónozási lépések nélkül. Ez összekapcsolt transzkripciós/transzlációs rendszerekben történik. Az expressziós PCR-eljárással előállított sablonok mind a prokarióta, mind az eukarióta sejtmentes rendszerekben a hatékony fehérjeszintézishez szükséges összes elemet tartalmazzák, és adott esetben különféle N- vagy C-terminális affinitásjelzőket kódoló szekvenciákkal vannak ellátva. Ezzel a módszerrel N-terminális szignálszekvenciák hozzáadása is szükséges, amelyek szükségesek a membránfehérjék és a szekretált fehérjék proteoliposzómákba történő célzásához. Az expressziós PCR ezért fontos eszköz a fehérjék célzott tervezésében, mivel ezzel a módszerrel mutációk vezethetők be, és a szintetizált fehérjék evolúciós folyamatban módosíthatók funkcionális tulajdonságaikban és adaptálhatók a technológiai követelményekhez.
A módosított és mesterséges aminosavak beépítését, amelyeket kotranszlációs úton vezetnek be a növekvő fehérje láncokba pre-acilezett tRNS-ek segítségével, prokarióta és eukarióta sejtmentes fehérjeszintézis rendszerekben hajtják végre. A meghatározott fehérjekonjugátumokat, különösen a membrán és a glikoprotein konjugátumokat biotinilezett vagy fluoreszcens csoportokkal, szintetizáljuk ilyen módon sejtek nélkül. A ko-transzlációs, helyspecifikus fehérje jelölések kíméletes módszerek, amelyek jelentősen leegyszerűsítik a termelt fehérjék funkcionális jellemzését. A beépített biotinilezett vagy fluoreszcens aminosav kimutathatósága lehetővé teszi a megfelelő jelölésű membránfehérjék lokalizálását a lipidmembránszerkezetekben, valamint a ligandum kölcsönhatás hatékony detektálását. Az expressziós PCR-rel együtt sokféle jelölt fehérje szintetizálható gyorsan a szűrési alkalmazásokhoz. Ezenkívül ezt a módszert használják fehérjék előállítására molekuláris kapcsolók formájában, amelyek külső jelre reagálva megváltoztatják a fluoreszcencia emissziójukat.
Kapcsolattartó:
Dr. Stefan Kubick
Fraunhofer Orvostechnikai Intézet IBMT
Celluláris Biotechnológiai és Biochip osztály
Sejtmentes fehérjeszintézis csoport
Telefon: 0331/58187-306
E-mail: [email protected]
További információ:
A sajtóközlemény jellemzői:
Újságírók, üzleti képviselők, tudósok
Biológia, táplálkozás/egészség/gondozás, orvostudomány
régiónkénti
Kutatás/ismeretátadás, kutatási eredmények
német