Universitätsklinikum Hamburg - Eppendorf - PDF ingyenes letöltés
Hamburgi Egyetemi Orvosi Központ - Eppendorf Kísérleti Orvostudományi Centrum Molekuláris Sejtbiológiai Intézet Igazgató: Prof. Dr. rer. Physiol. Dr. H. c. Ulrike Beisiegel A hepatomegalia mechanizmusáról a vas túlterheléses betegségekben. A génexpresszió vizsgálata patkány állatmodellben Értekezés a hamburgi hamburgi egyetem - Eppendorf Orvostudományi Kar DOKTOR GYÓGYSZER fokozatának megszerzéséhez: Ehsan Khaljani Teheránban született/Irán, Hamburg 2010
Az orvosi kar elfogadta: 2010.10.25. A Hamburgi Egyetem orvosi karának jóváhagyásával megjelent tudományos felügyelet: PD Dr. Dr. Peter Nielsen Audit Bizottság, elnöke: Prof. Dr. Dr. Ulrieke Beisiegel vizsgabizottság: 2. bíráló: PD Dr. Dr. Peter Nielsen vizsgabizottság: 3. bíráló: Prof. Dr. Böger R. - 1 -
Tartalom 1. Bevezetés A vas metabolizmusa 5 A vas gyógyászati jelentősége 12 Máj: funkció és fiziológia 16 A máj megnagyobbodása 17 Az állatmodell leírása és a zsírcsoport jelentősége 18 A vas túlterhelésének elve a TMH Ferrozennel 19 Szövettan 20 A génexpresszió változásai patkány állatmodellben 20 27. kérdés 2. Kísérletek (anyag és módszerek) Szonográfiai májtérfogat-vizsgálat 28 In vivo máj-vas-koncentráció meghatározása SQUID-vel 29 A betegek adatainak statisztikai értékelése 30 Patkány-állatmodell TMH-ferrosszal 32 A máj eltávolítása 33 A patkány máj vas-koncentrációjának meghatározása in vitro 34 A patkánymáj szövettani feldolgozása 35 A DNS, a fehérjék és az RNS izolálása az RT-hez rt PCR 36 RNS gél elektroforézis 38 Az RNS átírása a cdna-ban 40 A primerek generálása és rendezése 41 Az rt rt PCR elvégzése 44 Az rt rt PCR-adatok statisztikai értékelése 45 DNS-gél elektroforézis 49 Western-blotok elvégzése p-act 5-vel 0-3 -
3. Eredmények A betegadatok statisztikai értékelése 51 Patkánymáj térfogata 53 A patkány máj vaskoncentrációjának meghatározása in vitro 54 A patkánymáj szövettani feldolgozása 55 Patkánymáj-tömeg 56 Az rt rt PCR értékelése és a Western-blotok eredményei 57 DNS-gél elektroforézis 68 4. Megbeszélés A betegadatok megvitatása 69 Szövettan 70 Az rt rt PCR és a Western blotok adatainak megvitatása 71 Következtetés 77 5. Összefoglalás 80 6. A rövidítések listája 82 7. Források és hivatkozások 83 8. Függelék (kiegészítések) rt rt PCR görbék 88 DNS gél elektroforézis 88 Általános táplálási fájl 92 9. Köszönetnyilvánítás 93 10. CV 94 11. Nyilatkozat 96-4 -
2. ábra A vas kétféleképpen jut be a testbe. Vagy HCP1-en keresztül hem formájában, vagy redukált növényi vasként DMT1-en keresztül. A hem-oxigenáz segítségével a vas felszabadul a hemből. Donovan és munkatársai (Physiology 21: 115-123,2006) szerint itt Hephaestin, egy réztartalmú ferrooxidáz alakítja vissza háromértékű alakjába oldhatóságának megváltoztatása céljából, végül transzferrinhez kötődve juttatja rendeltetési helyére (11). 3. ábra: A Hephaestin helyzete az enterociták bazolaterális falán. Itt alakul a vas háromértékű alakjává és kötődik a transzferrinhez. Ferroportin mutáció autoszomális domináns hemochromatosisban: funkcióvesztés, megértés erősödése, Fleming et al (2001) - 7 -
Ugyanez vonatkozik a transzferrin receptorra. 6. ábra A vasszabályozó fehérjék a transzferrin receptor mRNS 3-végéhez kötődnek a jellegzetes szár-hurok szerkezethez, és így biztosítják az mrna csökkent lebomlását (kevés lebomlás). Sanchez és mtsai (2006) szerint ezen mechanizmus révén a vas beépül az IRP1 vas-kén klaszterébe (az IRP1 leválik az IRE-ről), így a DMT1 csökkent expressziója miatt csökken a vasfelvétel, és a fent leírt ciklus újrakezdődhet. . A bemutatott szabályozás azonban az mrna nem lefordított végén is megtörténhet, ahol ellentétes hatás, azaz fordítási korlátozás figyelhető meg (21,22). A 7. ábra az IRP-k a ferritin mRNS 5 végéhez kötődnek, és így megakadályozzák az mrna transzlációját. Sanchez és mtsai (2006) szerint - 10 -
Időközben számos IRE motívumot hordozó gén ismert, amelyek akár biokompaktívan, tömbök nélkül is sikeresen azonosíthatók. A biokomponens azt jelenti, hogy a motívumokat speciális számítógépes keresőszoftverrel rögzítik, a PubMed ismert mrna szekvenciái alapján. 8. ábra Az IRE-t hordozó gének ábrázolása, amelyeket biokompaktummal azonosítottak. Vasszabályozás és a sejtciklus, M Sanchez és mtsai., J Biol Chem. 2006, aug. 11; 281 (32): 22865-74. Epub 2006. június 7. Miután az abszorbeált vas transzferrin a célsejtbe szállította, a vas polimer vas-oxid-hidroxid-foszfát formájában a ferritinben tárolódik. 9. ábra A röntgenkristályos grafikával előállított ferritin ezen képe az ásványi vas tárolását mutatja a ferritinmag közepén (barna). Casidy et al. 2004 A Ferritin képes felszabadítani a vasat a raktárakból, vagy tovább tudja tárolni a vasat, a szervezet igényeitől függően. - 11 -
11. ábra: A lipidperoxidáció elve és következményei Nielsen és munkatársai (2006) szerint sok más klinikai kép ismert a vas túlterhelésével kapcsolatban, bár a tünetek súlyossága a megfelelő genetikai variációtól függ. A szívizomsejtek vasat tárolnak, ami toxikus szívizomfibrózishoz vezet. A hemochromatosis során pluriglandularis elégtelenséggel járó hasnyálmirigy-fibrózis léphet fel a hasnyálmirigyben, amely másodlagos diabetes mellitushoz vezethet. Ezt bronz cukorbetegségnek is hívják a bőr túlzott pigmentációja miatt. A plazmasejt-sziderózis gyakran diagnosztizálható a csontvelőben, amelyet a vas durva intralizoszomális lerakódása jellemez a mag közelében (28). A vaslerakódások minden esetben kimutathatók a klasszikus porosz kék színnel. A betegség komplex hemochromatosis négy alformára oszlik. A tünetek és a súlyosság különbözőek. Az 1. típusú hemochromatosis a nyugati világ leggyakoribb altípusa (29), és ebben a doktori disszertációban páciensvizsgálatok is tárgyát képezik. - 14 -
Májvas (mg/g májtömeg) 35 30 25 20 15 10 5 0 Máj-vas koncentráció TMH-Ferrozen-tápláló H mochromatózzal 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 táplálási idő hetekben 14. ábra Az ábra a májban történő vasraktározás menetét mutatja mg/g májtömegben az etetés időtartamához viszonyítva. Az etetési idő növekedésével a máj vasmennyiségének fennsíkja érhető el. Nielsen 2006 1.7. Szövettan A korábbi vizsgálatok még nem tudták tisztázni, hogy a patkányokban a vas túlterhelés miatt megnövekedett máj hipertrófiás-e, vagy a proliferáció miatt megnövekedett-e. A gyulladást sem zárják még ki. 1.8. A génexpresszió változásai a patkány állatmodellben Annak a feltételezésnek az alapján, hogy a vas és a zsír túlterhelése a génexpresszió variációihoz vezet, a szóban forgó anyagcsere útvonalak reprezentatív markereinek transzkripcióját vizsgálták (15. ábra), amelyet az alábbiakban részletesebben tárgyalunk. 15. ábra: A máj a különféle anyagcsere folyamatok középpontjában - 20 -
17. ábra: IGF-1 a hipotalamusz hipofízisének máj-csont tengelyének részeként. Az IGF-1-et közvetlenül a növekedési hormon befolyásolja, és a hipertrófia mediátora. Forrás: http://www.mfi.ku.dk A hordozófehérjék (IGF-BP 1-6 = Az inzulinhoz hasonló növekedési faktor - kötő fehérje) az IGF-1 szekréciója után kötődnek a plazmához, és szintén növekedési hormon alatt vannak. és az inzulinszabályozás. Ezek a hormonok határozzák meg, hogy az IGF1 mikor tud elszakadni a megkötő fehérjéitől, áttérhet-e az aktív formára és végül megkötődhet a receptorához (IGF-R = inzulinszerű növekedési faktor receptor). Tetramerszerkezetével és intracelluláris tirozin-kináz aktivitásával az IGF-R hasonlít az inzulinreceptorra, és lehetővé teszi az IGF-1 számára az intracelluláris jelkaszkádok elindítását. A szignálszekvencia eredménye ezután a fokozott fehérje bioszintézis, a proteolízis gátlása, a timidinek beépítése a DNS-be és a szulfátok beépülése a proteoglikánokba (24). A hipertrófia markerek hatását fehérje szinten is követték. Az AKT-1 foszforilezését Western-blotokkal vettük figyelembe. - 24 -
A 18. ábra: Az IGF-1 és az AKT jelátviteli út közvetlenül kapcsolódik az anti-apoptotikus útvonalakhoz. Forrás: www.biocarta.com, módosítva Khaljani 2008-ból. Az AKT-1 egy fehérje kináz különböző jelátviteli kaszkád útvonalakhoz (például apoptózis, sejtciklus-folyamatok, anigiogenezis), de az AKT-1 közvetlenül kapcsolódik az IGF-1-hez. Így az AKT-1 az IGF-1 anti-apoptotikus hatását közvetíti annak növelésével. A megnövekedett AKT-1 nélküli hipertrófia nagyrészt kizárható, mert a hipertrófia útjaiban is központi mediátor. Mindazonáltal figyelembe kell venni az ACT-re a vasat befolyásoló különféle tényezőket, mivel a vas mint káros anyag különböző anyagcsere útvonalakban lép fel. Gyulladásos gének A túlzott sejtnövekedésnek más okai lehetnek a proliferáción és a hipertrófián kívül. Ebben az összefüggésben a máj megnagyobbodása lehetséges egy gyulladásos folyamat során, amelyet gyulladásjelzők megnézésével szerettünk volna megfigyelni. Az irodalomban klasszikusan idézett gyulladáscsökkentő marker a TNF-a (tumor necrosis factor-a), amelyet ezért mi is kiválasztottunk tanulmányunkhoz. - 25 -
1.9. Kérdés A következő kérdésekre kell megválaszolni a jelen tanulmányt: 1. A vas túlterhelése hepatomegáliához vezet-e az emberekben, csakúgy, mint a patkányokban? 2. A betegek esetleges májnagyobbodása közvetlenül függ-e a máj vaskoncentrációjától? 3. Mely gének játszanak szerepet patkányokban a vas által kiváltott májnövekedésben: proliferáció, hipertrófia vagy gyulladás, és mit mutat a szövettan? 4. A vas és a zsír túlterhelése okoz-e hasonló reakciókat a génexpresszió és a fehérje szintjén? - 27 -
2. Kísérletek (anyag és módszerek) 2.1. Szonográfiai májtérfogat-vizsgálat Anyag: - Ultrahangos készülék: Picker CS 9500 - Ultrahangos kontakt gél: Caesar és Loritz - Vákuummatrac: Vac Fix As - Mozgatható kanapé A máj térfogatának meghatározásához a betegek a hátukon fekszenek, hogy a bordaív alatti máj a lehető legkönnyebben elérhető legyen nyereség. Ezt követően ultrahangos képeket készítettünk a szagittális síkban az ultrahangfej segítségével lézer vezérléssel, 2 cm távolságra. A májterületet kézzel kellett megjelölni a képeken, és meg kell szorozni a 2 cm-es szeletvastagsággal. A 8 szekcionált kép eredményeinek összeadása után a máj térfogata hozzávetőleges volt. A munkát Rainer Engelhardt és Roland Fischer szíves támogatásával végezték az Eppendorfi Egyetemi Kórház Női és Gyermekgyógyászati Központjának, Gyermekgyógyászati Hematológiai és Onkológiai Klinikájának és Poliklinikájának vas-anyagcsere klinikájából. 19. ábra Kivonat a beteg aktából. Feljegyezzük az azonosító számot (ID), a nemet (nemet), a hemochromatosis mutációt (C282Y, H63D), a diagnózist, a súlyt, a magasságot, valamint a mért májtérfogatot (Vol-liv) és a máj vaskoncentrációját (LIC) - 28. -
Kezdetben a Gs a-t (egy stimuláló G-fehérje alfa-alegységét) is mértük, amely összehasonlítható adatokat mutatott. A GAPDH azonban megbízhatóbbnak bizonyult a gyakorlati munkában, így a célgének expressziója összefüggött a GAPDH-val. 3.7. DNS-gél elektroforézis A DNS-gélek képei a függelékben találhatók. A képeket arra használjuk, hogy ellenőrizzük az RT PCR-t a nem kívánt melléktermékek és szennyeződések szempontjából. A DNS-gél felhasználható annak meghatározására is, hogy a várt termék megfelelő-e, amelyet a kép bal oldalán található 100 bp létrával ellenőrizni lehet. A létra első, alsó sávja 100 bp, a második 200 bp, stb. Mivel csak olyan primereket használtunk, amelyek tiszta PCR termékeket mutattak a gélben a próbaüzem során, az összes gélképen csak egy tiszta sáv látható a megfelelő szinten. A mennyiség az amplifikált DNS méretétől függ, amelyet a primerek felsorolása tartalmaz. A PCR kontroll minden képen a helyes PCR termékméretet mutatja, és negatív a szennyeződés szempontjából. - 68 -