Viselkedési farmakológiai és molekuláris biológiai vizsgálatok az ópiátok megvonásáról patkányokban -
Viselkedési farmakológiai és molekuláris biológiai vizsgálatok az ópiátok megvonásáról patkányokban A müncheni Ludwig Maximilian Egyetem Biológiai Karának Biológiai Karának értekezése, Dipl.-Biol. Christian Kirschke 2001. október 31-én
Első jelentés: Második jelentés: Különleges jelentés: Prof. Dr. Rainer Landgraf Prof. Dr. Peter Schlegel Prof. Dr. Rainer Spanagel szóbeli vizsga napja: 2002. június 17
Tartalomjegyzék 1. Általános bevezetés 3 2.1. Bevezetés [S 35] -GTPγS autoradiográfiai vizsgálat 11 2.2. Anyag és módszerek [S 35] -GTPγS autoradiográfiai vizsgálat 17 2.2.1. Állatok és állattenyésztés 17 2.2.2. Vizsgálati eljárás és csoporttervezés 17 1. kísérlet 17 2. kísérlet 18 3. kísérlet 19 2.2.3. Az agyterületek kiválasztása 19 2.2.4. [S 35] -GTPγS autoradiográfia 21 2.2.5. [H3] -DAMGO kötődési vizsgálat 22 2.2.6. Értékelés és statisztika 23 2.3. Eredmények [S 35] -GTPγS autoradiográfiai vizsgálat 25 1. kísérlet 25 2. kísérlet 31 3. kísérlet 35 2.4. Beszélgetés [S 35] -GTPγS autoradiográfiai vizsgálat 37 3.1. Bevezetés az alacsony dózisú naloxon koncepcióba 42 3.2. Anyag és módszerek alacsony dózisú naloxon fogalom 46 3.2.1 Állatok és állattenyésztés 46 3.2.2 Morfium pelletek 46 3.2.3. Kísérletek nyílt terepen 47 Alacsony dózisú akut naloxon beadása 47 Szenzibilizáció 48 3.2.4. Kísérletek Skinner-dobozokban 49 kábítószer-diszkrimináció 49 Opiát-kivonás Skinner-dobozokban 50 3.2.5. Kísérlet a megfigyelő dobozokban 51 3.2.6. Értékelés és statisztika 52 3.3. Az alacsony dózisú naloxon-koncepció eredményei 54 Morfium-pellet 54 Kísérletek szabad terepen 55 Kísérletek Skinner-dobozokban 58 Kísérletek megfigyelési dobozokban 61 3.4. Az alacsony dózisú naloxon-koncepció ismertetése 63
4.1. Feltételes megvonás kiváltása 68 4.2. A kondicionált kivonás anyaga és módszerei 74 4.2.1. Állatok és állattenyésztés 74 4.2.2. A kondicionált kivonás állatmodellje 75 4.2.3. Kísérlet a nyílt terepen 77 4.2.4. Hyperalgesia teszt (főzőlap) 77 4.2.5. A stresszhormonok mérése 77 4.2.6. Az állatmodell összehasonlítása a stressz paradigmával 78 4.2.7. in situ hibridizáció 79 4.2.8. Memantin beavatkozása 82 4.2.9. Értékelés és statisztika 82 4.3. A kondicionált megvonás eredményei 83 1. rész: Állati modell a kondicionált megvonási tünetek mérésére 83 2. rész: in situ hibridizáció 96 3. rész: Farmakológiai beavatkozás memantin alkalmazásával 99 4.4. A feltételes megvonás ismertetése 106 1. rész: Állati modell a kondicionált elvonási tünetek mérésére 106 2. rész: In situ hibridizáció 109 3. rész: Farmakológiai beavatkozás memantin felhasználásával 111 5. Következtetés 113 6. Irodalomjegyzék 116 Köszönetnyilvánítás 131 Curriculum vitae 132
Még mindig nincsenek ismeretek a μ-opioid receptorhoz kapcsolt G-fehérjék aktivitásáról a megvonás során, ezért nem tisztázott az a kérdés, hogy a megvonás során a túlzott idegsejt-aktivitást mennyire befolyásolják a G-fehérjék és azok funkcionalitása. Ennek a tanulmánynak a célja tehát a µ-opioid receptorhoz kapcsolt G fehérjék aktivitásának megvizsgálása megvonáskor, különféle paraméterek figyelembevételével. A vizsgálat módszere Sim és mtsai. (1995) tovább fejlesztette az [S 35] -GTPγS autoradiográfiát, amely lehetővé teszi ennek az aktivitásmérésnek az elvégzését az agy nagyrészt ép szakaszán, és ezzel egyidejűleg meghatározza ennek a tevékenységnek az anatómiai lokalizációját. Ez lehetővé teszi további molekuláris biológiai vizsgálati módszerek (például egy ligandumkötési vizsgálat) elvégzését ugyanazon az agyon annak érdekében, hogy kimutassák a receptorkötés és a G-fehérje aktivációja közötti kölcsönhatásbeli különbségeket. 16.
10 10 +5 +5 0 0-5 -5 -10 -10 -10 -10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0 -5 +15 +10 +5 0 -5 Nucleus accumbens Interaural 10,60 mm Bregma 1,60 mm 10 10 +5 +5 0 0-5 -5-10-10-15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 LV Az amygdala II középső magja Interaural 6,70 mm Bregma -2,30 mm 10 10 +5 +5 0 0-5 -5-10 -15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 Locus coeruleus Nucleus parabrachialis Interaural -0,80 mm Bregma -9,80 mm 4. ábra: A vizsgált agyterületek ábrázolása és elhelyezkedése. Paxinos és Watson (1998) 20 módosított ábrázolása
2.2.6. Értékelés és statisztika Az [S 35] -GTPγS autoradiográfia és statisztikák értékelése: A kidolgozott filmeket egy videokamera (Sony XC-77) segítségével digitalizálták, és számítógépes támogatással (Optimas, BioScan) értékelték. Az egyes agyi régiók feketedésének mértékét denzitometriával rögzítettük, és az [S 35] radioaktivitást egy alkalmazott [C 14] standard (NEN) és egy számított konverziós tényező összehasonlításával határoztuk meg. Az eredményt nci/g-ban fejeztük ki. A konverziós tényezőt úgy számoltuk, hogy az inkubált szakaszokat lehúztuk a tárgylemezekről, meghatároztuk a súlyt és meghatároztuk a radioaktivitást folyadék szcintilátor fotometriával. A konverziós tényezőt a szürke szintek és az alkalmazott [C 14] standard alapján számítottuk ki a folyadék szcintilátor spektrofotometria eredményei alapján. A kapott adatokat a csoport átlaga ± standard hiba (SEM) formájában fejeztük ki. A statisztikai számításokat kétfaktoros varianciaanalízissel végeztük (ANOVA, A faktor: stimuláció alapmérése versus DAMGO stimuláció, B faktor: csoportok). A későbbi post hoc tesztként Newman-Keuls tesztet alkalmaztunk. Ha a hiba valószínűsége p