Vita szakmai gyakorlat Marie Helene Guilleux glutamát dehidrogenáz tisztítás EC 1

Glutamát dehidrogenáz EC 1.4.1.4 tisztítása a Pisum sativum magjából - Marie-Hélène Guilleux - 2004

Megbeszélés - következtetés - perspektívák

1. rész: tisztítás

nál nél. Nyers kivonat és ammónium-szulfát kicsapás

Az első tisztítási lépés csak az 1-hez közeli tisztítási tényező elérését teszi lehetővé. Ammónium-szulfáttal történő kicsapást követően az összes fehérje 64% -a visszanyerhető, ez a lépés tehát hozzájárult a fehérjék eliminációjához.

Azonban a teljes GDH amino-aktivitás csak 59% -a nyerhető vissza. Az enzimatikus aktivitás ezen elvesztése a GDH inaktiválásával magyarázható ammónium-szulfáttal végzett kezelést követően. A só által kiváltott nagy ionerősség az enzim denaturálódását okozhatja.

A GDH dezamináló aktivitása 14181 nmol.min -1 a nyers extraktumban és 8448 nmol.min -1 a mintában (NH4) 2S04-tal történő kicsapás után. Tehát annyi amináló aktivitás van, mint annyi dezamináló aktivitás. Számos hipotézis magyarázhatja ezeket az eredményeket:

b. DEAE-cellulóz anioncserélő kromatográfia

Mivel nincsenek adatok a vizsgált enzimről, nem tudtuk, hogy az enzim kötődik-e a gél dietil-amino-etil-csoportjaihoz (DEAE). A GDH teljes amináló aktivitásának 49% -a NaCl-dal végzett eluálás után található. Tehát az amináló aktivitás 83% -a megtalálható az előző lépéshez képest.

A fehérje megkötődött, ami azt jelenti, hogy pH 7,5-nél a NADPH-GDH negatív teljes elektromos töltéssel rendelkezik.

Ez a tapasztalat további információkat nyújt számunkra. A DEAE pKa értéke 9,5, azaz pH = 9,5 esetén a DEAE teljes nulla elektromos töltéssel rendelkezik. PH = 7,5 (azaz pKa-2) esetén a DEAE teljes elektromos töltése pozitív.

A tapadás érdekében az enzimnek negatív teljes elektromos töltéssel kell rendelkeznie pH 7,5-nél. Így arra következtethetünk, hogy az enzim izoelektromos pontja 5,5 körül van, vagyis pH 5,5-nél az enzim annyi pozitív töltést hordoz, mint negatív töltés.

Ezek az adatok azért fontosak, mert jellemzik az enzimet. Az értéket azonban a tiszta NADPH-GDH-n kell megadni.

Ez a tisztítási lépés lehetővé teszi az összes GDH-amináló aktivitás 49% -os kitermelését, és az összes fehérje 43% -át nyerik ki. A tisztítási tényező növekszik és eléri az 1,76 értéket, csakúgy, mint a GDH fajlagos aktivitása (6,7 nmol.min -1. Mg -1).

Ezenkívül az elúciós profilon két csúcs figyelhető meg. Ez a két csúcs hasonló a teljes aktivitás, a fajlagos aktivitás, a tisztítási tényező, az összes fehérje mennyisége és a hozam szempontjából. Ez a két csúcs a GDH több izoformájának létezésével magyarázható.

Ami a dezamináló aktivitást illeti, az csak a POOL 1-ben található 704 nmol.min -1 sebességgel .

A POOL 1 eredményeinek különböző értelmezése lehetséges:

Ez lehet az izoform dezamináló aktivitása [EC 1.4.1.2]. Ebben az esetben ez a tisztítási lépés lehetővé tette volna az izoform [EC 1.4.1.4] és az izoform [EC 1.4.1.2] részleges elválasztását, mivel az amináló aktivitás 44% -a a POOL 1-ben található, szemben a 8% -os dezaminálással. aktivitás, összehasonlítva az ammónium-szulfátos kicsapási lépéssel.
Lehet, hogy a dezamináló aktivitás az izoform [EC 1.4.1.4] nem preferenciális, amely az amináló aktivitás 19% -át képviseli. Ebben az esetben csak a GDH [EC 1.4.1.4] lenne jelen ebben a készletben.

A POOL 2-ben nem találtak dezamináló tevékenységet. Ez megint a következőkkel magyarázható:

Ez lehet az izoform [EC 1.4.1.4], amely később eluálódik, mint az első pool. Ez a jelenség az ammónium-szulfáttal végzett kezelésnek tudható be, amely megváltoztathatta a tercier struktúrát, és ezért magatartásbeli különbségeket von maga után.
Lehet, hogy az izoform [EC 1.4.1.3] reagál ily módon a kiválasztott körülmények között (pH.).

A két medence mindegyikéhez izoformák keveréke is lehet.

vs. Pigment affinitáskromatográfia

A pigment gél egy zöld gyantából áll, amelyen kovalensen kötődnek a ligandumok, amelyek szerkezete hasonló a NAD (P) szerkezetéhez. A NAD (P) kofaktoroktól függő enzimek képesek lesznek kötődni hozzá. Valóban, a teljes aminant GDH aktivitás nagy részét NaCl-dal végzett eluálás után nyerjük vissza (33% az előző tisztítási lépéssel összehasonlítva).

Ennek a lépésnek a következtében sok teljes fehérje eliminálódik (az előző fehérjéhez képest a teljes fehérje mindössze 2,4% -a marad meg), ami lehetővé teszi a 23,89-es tisztítási tényező elérését. A fajlagos aktivitás szintén növekszik és eléri a 90,8 nmol.min -1. Mg -1 értéket, ami bizonyítja a tisztítás hatékonyságát.