56. nephrectomia magas sótartalmú étrenddel és nitrogén-oxid-szintáz gátlással kombinálva az indukáláshoz

Összegzés

Kétlépcsős eljárást írnak le a krónikus veseelégtelenség (CRF) megállapítására Lewis patkányban a vese tömegének 5/6-os műtéti eltávolításával. A műtéti beavatkozás, az NOS-gátlás és a magas sótartalmú étrend kombinációja az emberi CKD-hez hasonló modellhez vezet, lehetővé téve az oksági mechanizmusok tanulmányozását és új terápiás beavatkozások kidolgozását.

Absztrakt

Bevezetés

Progresszív jellege, a későbbi végstádiumú vesebetegségek, valamint a kapcsolódó kardiovaszkuláris morbiditás és mortalitás miatt a CKD egyre növekvő népegészségügyi probléma. Ezért a CKD progressziójának lelassítása nagy egészségügyi prioritás. Mivel a CKD-t a homeosztázis összetett rendellenességei jellemzik, integratív állatmodellekre van szükség a CKD kialakulásának és progressziójának tanulmányozásához. A vese különféle sejttípusok sokaságából áll, amelyek kölcsönhatásba lépnek egymással. Ezt a bonyolultságot nem lehet utánozni in vitro.

Jegyzőkönyv

Valamennyi kísérletet az utrechti laboratóriumi állatbizottság állatkísérleti etikai irányelveinek megfelelően hajtják végre. A protokoll a szerző Intézet Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának irányításával és jóváhagyásával zajlik.

A CKD-t hím beltenyésztett Lewis patkányokban (Charles River, Sulzfeld, Németország) 8 hetes korban indukálják. A patkányokat normál körülmények között, fény, hőmérséklet és páratartalom mellett szabályozott környezetben tartják.

1. Sterilizálja a sebészeti műszereket:
   • 1 tanuló 1-2 fogat 12 cm-rel elnyom
   • 1 tanuló szabványos fogó
   • 2 Semken fogó
   • 1 Mayo olló
   • 1 tanuló írisz olló
   • 1 Olsen-Hegar tűtartó ollóval
   • Takaró
2. Készletlista ellenőrzése:
   • Műtőasztal melegítő párnával és lámpával
   • O2, izoflurán
   • szövet
   • Borotva
   • Mérleg
   • Steril működési alapérték
   • Steril géz 5x5 és 10x10
   • 70% alkohol
   • 0,9% -os NaCl-oldat
   • 1 ml-es fecskendő
   • Tűk (25G)
   • Gélhab betétek: Spongostane
   • Vicryl 4.0 és 5.0
   • Buprenorfin 0,03 mg/kg (1:10 arányban hígítva fiziológiás sóoldattal)
   • Tiszta ketrec patkányoknak a műtét után

2. Jobb oldali uninephrectomia

3. Bal oldali részösszeg nephrectomia

1. Hét nappal később ugyanazokat az előkészületeket végezzük a bal oldalon a jobb oldalon, a 2.1–2.5. Leírások szerint. A műtét előtt kiszámítják az eltávolítandó veseszövet mennyiségét, amely megközelítőleg a jobb vese súlyának kétharmada. Készítsen elő kis darab gélhabot (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) a műtét előtt.
2. Helyezzen éles ollót a bal vese felső pólusa köré és a felső pólus reszekcióját egy mozdulattal (az olló elhelyezkedését lásd: 3. ábra). Azonnal takarjon le egy darab gélhabot, és helyezzen enyhe nyomást steril gézzel.
3. Ismételje meg a vese alsó pólusával, mint a 3.3.
4. Emelje fel a vesét, hogy megakadályozza a bőrön való alvadást. Tartsa enyhe nyomást mindkét gélhab párnán steril gézzel, amíg a vérzés le nem áll. Ha a vérzés folytatódik, tegyen még egy habszőnyeget.
5. Helyezze a hasüregbe a maradék vese tapadó gélhabos párnákkal. Zárja be az izmokat és a bőrt, és kövesse a 2.9-2.12.

1. Az álfigyelésen ugyanezt az eljárást alkalmazták a vese kiszolgáltatására. A vese kiirtása vagy a botok egy héttel későbbi levágása helyett mindkét vesét egy hetes időközönként dekapszulálják, nem zavarva a mellékvesék megzavarását. A sebzárás és a posztoperatív ellátás a 2.11 és a 2.12-ig megegyezik.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A részösszeg után a nephrectomia kb. 1: 6 marad a teljes vese tömegből. 4. ábra mutatja a jobb vese eltávolított részének súlyát átlaggal és szórással két korábbi kísérletben. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy az UNX utáni héten a bal vese hipertrófiája jelentkezik, ami azt jelzi, hogy az a súly, amelyet a jobb vese súlya alapján kell kiszámítani, mindig kevesebb, mint 5/6-os távolságot eredményez. Mivel azonban a műtét során nem lehet meghatározni a bal vese súlyát, az eredeti vese tömegének kb.

Idővel a CKD-ben szenvedő patkányokban magas vérnyomás, urémia, vérszegénység, proteinuria és a GFR és az ERPF szignifikáns csökkenése alakul ki. 6 hét elteltével a CKD kialakult, ami megfelelő időpont a mentési intézkedések tesztelésére. Idővel a hipertónia és a proteinuria éles progressziója figyelhető meg, míg a hematokrit és a vesefunkció (GFR és ERPF) enyhe romlást mutat (5. ábra). További tünetek, amelyekre nem fókuszáltunk kísérleteink során, a kalcium-foszfát és a lipid anyagcseréjének rendellenességei és még sokan mások. A patkányok által okozott stressztől függően a CKD kialakulása nagymértékben változhat 14, 15, 2. Magas sótartalmú étrendet és NO blokkolót használtunk magas vérnyomás és endothel diszfunkció kiváltására.

A veseelégtelenség progresszióját a vizelet (a fehérje és a kreatinin mennyiségének mérésére használt), a vér (a plazma karbamid és kreatinin) és a szisztolés vérnyomás gyűjtésével követik nyomon. Tisztában vagyunk azzal, hogy a magas vérnyomás kialakulása pontosabban követhető, ha a farok mandzsetta pletizmografia helyett telemetriát alkalmazunk. Kreatinin-clearance kiszámítható, de hajlamos alábecsülni a GFR csökkenését a patkányok 16-os extenzív tubuláris kreatinin-szekréciója miatt, hangsúlyozva az arany standard módszer fontosságát a vesefunkció meghatározásához az inulin és a PAH clearance meghatározásával 17, 18, 19 . Koeners és mtsai. Az inulin és a PAH clearance-ét a vizeletmintában (U), a vizelet áramlási sebességében (V) és plazmakoncentrációjukban (P) számítják ki. Korábban a GFR és az ERPF jelentős csökkenését mutattuk ki ebben a modellben a klasszikus clearance technológia alkalmazásával, míg ez kevésbé volt látható a plazma kreatinin, a plazma karbamid vagy a kreatinin clearance 13 változásaiból.

1. ábra: Az L-NNS időtartama, a magas sótartalmú étrend, az UNX és az SNX. Megadják a vese működésének hosszirányú mérését és a meghatározás végpontját. Az SNX igénye után hosszabb nyomon követéssel a 6% -os NaCl táplálkozás idővel folytatható.

98fig2.jpg "/>2. ábra: A mellékvese disszekciója. A mellékvese eltávolítása nélkül, anélkül, hogy megzavarná, helyezzen csipeszeket a zsírba a vese és a mellékvese közé, és haladjon az éroszlopról felfelé a hegyig, ahogy azt a piros vonal jelzi. Illusztráció az emberi test borzalmának anatómiájának 1918-as amerikai kiadásából.

3. ábra Nephrectomia részösszeg. A piros vonalak a vágóéleket mutatják. Illusztráció az emberi test borzalmának anatómiájának 1918-as amerikai kiadásából.

4. ábra. Az adag eltávolította a veseszövetet subtotal nephrectomia után két különböző kísérletben. Exp 1, n = 16, exp 2, n = 23.

5. ábra. A veseelégtelenség kialakulása CKD patkányokban az SNX (szaggatott vonalak n = 5) és az egészséges kontrollok (p = szaggatott vonalak n = 5) és a CKD patkányok SNX (12 n) után az egészséges kontrollok (12 n) után ). A CKD patkányok L-NNS-t kaptak a 4. hétig, és magas sótartalmú étrendet kaptak az 1. héttől a befejezésig (a grafikonon nem látható). Az SNX hipertóniát vált ki (farokpletizmográfiával mérve) (A), Uremia (B), anémia (C) és proteinuria (D) és a GFR jelentős csökkenése (E) és az ERPF (F) 13. * A megadott p előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

A vese tömegének 5/6-os részének műtéti eltávolítása a Lewis patkányban, magas sótartalmú étrenddel és ideiglenes NOS-gátlással kombinálva a CKD modelljéhez vezet, amely hasonlít az emberi CKD-re, és lehetővé teszi a terápiás beavatkozások ok-okozati mechanizmusainak és hatékonyságának vizsgálatát. CKD.

Az 5/6-os nephrectomia modell a CKD jól ismert és széles körben leírt modellje. A vese tömegének 5/6-osának egyszerű eltávolítása azonban nem okozott azonnal veseelégtelenséget minden patkánytörzsben. Lewis patkányokkal vizsgáljuk a sejtalapú terápiák hatásait a CKD-ben, mivel a GFP + Lewis patkányok rendelkezésre állása 21 sejtkövető beadott donorsejtet eredményezhet a befogadó (nonGFP +) patkányban. A Lewis patkány viszonylag ellenáll a veseelégtelenség kialakulásának, és a CKD fejlődése lassú a többi 22, 15 törzshez képest. Ezért az 5/6-os vesemennyiség eltávolítása NO-kimerüléssel és magas sótartalmú étrenddel kombinálódik, mivel ez hasonlít az emberi CKD számos aspektusához, például a magas sófogyasztáshoz és az endotheliális diszfunkcióhoz. Az olvasóknak szem előtt kell tartaniuk, hogy az 5/6-os nephrectomia kombinációjának szükségessége magas sótartalmú étrend és/vagy fáradtság nélkül a kísérletekhez használt patkányok törzsétől függ.

Az 5/6-os nephrectomiát kétlépcsős eljárásban hajtottuk végre, nem pedig egylépéses eljárásban, mivel ezt kevésbé stresszesnek tekintik az állat számára, kevésbé jár a műtéttel összefüggő halálozással, és ezt az állatkísérleti bizottságunk is előnyben részesíti. A vesék eléréséhez a laparatomia helyett a szélső bemetszést részesítettük előnyben, mivel a laparotómiával magasabb a sebfertőzés kockázata, az öltések fellazulása, a szubkután porckorongsérv és a bél tapadásai, mint a szélső metszés. Továbbá, ha a kísérleti tervezés hasi bemetszéssel járó beavatkozást foglal magában - amint ez a csontvelősejtek maradék vese artériába történő beadására vonatkozó kísérletünkben az SNX esetében nem ajánlott, mivel kerülni kell az ismételt laparotómiákat.

Számos kritikus probléma merülhet fel a vese tömegének 5/6-os részének műtéti eltávolítása után. Az UNX során nehézségekbe ütközhet a vese stabilizálása, mivel a környező zsír könnyen fellazul. Két módszer használható a vese kitettségére. 1) Használjon kisebb csipeszeket, hogy megkapja a vese ereket, finoman lefelé haladva a vese alsó pólusától az erek felé, és finoman húzva addig, amíg a vese stabilizálódni nem tud. 2) Tompa csipesszel óvatosan távolítsa el a vesét a hasáról. Amikor a vese ki van téve, a géz felhasználható az ebben a folyamatban fellépő vérzés leállítására. A vérzés elkerülése érdekében a zsír a vese alsó pólusánál kezd húzódni, ahol a zsír erősen kapcsolódik a veséhez.

Fontos, hogy a veseedény és a vese körüli csomó között létrejöjjön, hogy megakadályozza a vese eltávolítását követő vérzést, mivel a csomó a beérkező véráramlás miatt lecsúszik a vese erekről, gyorsan megtöltve a hasat vérrel. Gézzel lehet eltávolítani a vért, és nyomással lehet megállítani a vérzést. Csipesszel megragadhatja a vesét és új ligatúrát hozhat létre. Ha a vese erek nem nyomon követhetők, tartsa nyomva, amíg a vérzés le nem áll. 1 ml fiziológiás sóoldat a hasüregi vérzés miatti kiszáradás megelőzésére, és várjon körülbelül 5 percet, mielőtt lezárná az izom- és bőrréteget. A patkányokat a következő napokon gondosan figyelemmel kíséri. Ha a kötszer a vese eltávolítása után már létezik, de a vese erek kifutnak, a kötés hosszú végei felhasználhatók az erek lekapcsolására.

Ha a oszlop felboncolása ellenére a habzselé párnáinak nyomása fennáll, ha vérzik, akkor ez valószínűleg egy nagy veseartéria vagy vesemedence sérülése miatt következik be. Ezt a vérzést meg lehet akadályozni úgy, hogy új gélhabos párnákat helyezünk a sebre, nem zavarjuk a habpárna mozgatását, miközben felemelem a maradékot, mivel a nagyobb erek a köldök közelében vannak, és hosszabb ideig várunk.

A vér a vizeletben a műtét után 2 nappal visszatérhet. Ha a vesemedence sérült, vagy nagy a vesefunkció vérzése, akkor fennmaradó hematuria nyoma lesz. A műtét után tartósan hematuriás patkányokat meg kell semmisíteni, mivel a vérzést nem lehet megállítani. Ha a hematuria a műtét után egy későbbi időpontban figyelhető meg, amely akár 2 héttel is előfordulhat a műtét után, a patkányt szintén meg kell eutanizálni, mivel a vér alvadt a vesemedencében, és végül eltömíti az uretereket és a hólyagot, elzáródást okozva.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

---