A disszeminált kandidózis nem invazív képalkotása a zebrafish lárvák protokolljában (lefordítva francia nyelvre)

Összegzés

A zebrafish gyors fejlődése, kis mérete és átláthatósága jelentős előnyökkel jár az 1-4. Fertőzés veleszületett immunszabályozásának tanulmányozása szempontjából. Itt bemutatjuk a zebrafish lárvák fertőzésének technikáit a Candida albicans gombás kórokozó alkalmazásával. Mikroinjekcióval a fagocita NADPH oxidáz aktivitásának a közelmúltban alkalmazott módszertanának a gombás dimorfizmus szabályozásában való felhasználása 5 .

Absztrakt

A Candida albicans kórokozó által okozott disszeminált candidiasis klinikailag fontos probléma a kórházi betegeknél, és 30-40% -nak tulajdonítható mortalitási arányhoz kapcsolódik. mivel a fagocita NADPH-oxidáz hajlamosabb a candidemia 7-9-re. A C. albicans és a veleszületett immunsejtek közötti kölcsönhatás dinamikájáról in vivo nagyon keveset tudni. Széleskörű in vitro vizsgálatok igazolták, hogy a C. albicans a gazdaszervezeten kívül csírázik a makrofágokban, és a 10–14-es neutrofilek gyorsan elpusztítják. Bár az in vitro vizsgálatok hasznosak, nem tudják összefoglalni a komplexet egy in vivo környezetben, amely idővel magában foglalja a citokinszintek dinamikáját, az extracelluláris mátrix kötődéseit és a sejtek közötti kontaktusokat 10, 15-18. E tényezők hozzájárulása a gazda-patogén kölcsönhatáshoz feltétlenül szükséges egy olyan modellszervezet megtalálására, amely intakt élő gazdaszervezetben nem invazív módon jeleníti meg a fertőzés ezen aspektusait.

A zebrafish lárva egyedülálló és sokoldalú gerinces gazdaszervezetet biztosít a fertőzés vizsgálatához. A fejlődés első 30 napjában a zebrafish lárváknak csak veleszületett immunvédelme van 2, 19-21, ami egyszerűsíti a velük született immunitástól nagymértékben függő betegségek, például a disszeminált candidiasis tanulmányozását. A zebrafish lárvák kis mérete és átláthatósága lehetővé teszi a fertőzés dinamikájának leképezését sejtszinten mind a gazda, mind a kórokozó számára. A veleszületett immunsejtekkel rendelkező fluoreszcens transzgénikus lárvák felhasználhatók a 22-24-es fertőzésben részt vevő specifikus sejttípusok azonosítására. A módosított antiszensz oligonukleotidok (morfolinok) felhasználhatók különböző immunkomponensek, például a fagocita NADPH-oxidáz leütésére és a gombás fertőzésre adott válasz változásainak tanulmányozására 5 literben. A kicsi alsó gerinces használatának etikai és gyakorlati előnyei mellett a zebrafish lárvák egyedülálló lehetőséget kínálnak a kórokozók közötti, és intravitalisan és színben egyaránt befogadó csatáról.

A zebrafish-t számos emberre patogén baktérium fertőzésének modellezésére használták, és szerepet játszott a mikobakteriális fertőzés megértésének nagy előrehaladásában 3, 25. Azonban ez csak nemrégiben sokkal nagyobb kórokozókkal, például gombákkal fertőzött egy lárva 5, 23, 26, és a mai napig nem volt részletes vizuális leírás a fertőzés módszertanáról. Itt bemutatjuk a prim zebrafish rhombencephalicus kamrai mikroinjekciójának technikáit, beleértve a korábbi protokollok módosítását. A gombás fertőzésre vonatkozó zebrafish lárva modellt használó eredményeink eltérnek az in vitro vizsgálatoktól, és megerősítik annak szükségességét, hogy a Petri-csésze egyszerűsített rendszere helyett a komplex gazda-környezetben vizsgáljuk a gazda-patogenekció interát 5.

Jegyzőkönyv

Az összes zebrafish-gondozási protokollt és kísérletet az Állatgondozási és Intézményi Felhasználási Bizottság (IACUC) A2009-11-01 protokollja alapján hajtották végre.

1. Morpholino és lárva injekciós edények

A kísérlet időtartama: * (10-15 perc)

Nehézségi fok: *

  1. Tojásinjekciókhoz készítsen 2% -os agarózoldatot steril vízben és mikrohullámú sütőben. Amikor az oldat kihűlt, öntsön belőle egy extra mély Petri-csészébe (Fisher Scientific), amíg az félig meg nem telik. Hűtsük le jégen, és győződjön meg róla, hogy a rács vízszintes.
  2. Miután az edény kihűlt, öntsön egy 15 ml-es felső réteget 2% agarózzal. Permetezzen be egy barázdált műanyag tojásinjekciós formát (Adaptive Science Tools) steril vízzel egy spray palackból. Óvatosan helyezze a barázdált oldalt lefelé a forró agaróz formába. Amikor az agar lehűlt, használjon egy lapos fém spatulát (VWR Scientific), hogy elkülönítse a penészt a kibővített agartól. Lassan távolítsa el a rácsot az agarózról. Embrió injekciós csomagolólemezek parafilmben (VWR Scientific) és fordított tárolókban 4 ° C-on.
  3. A lárvahalak injekcióihoz készítsen egy 2% -os agarózoldatot a leírás szerint. Öntsük az oldatot egy standard méretű Petri-csészébe (VWR Scientific), és tegyük félre, amíg megszilárdul. Csomagolja be a lárvainjekciós edényeket Parafilm-be, és fordított helyen tárolja 4 ° C-on.

2. Gombatermesztés előkészítése

A kísérlet időtartama: ** (30 perc)

Nehézségi fok: **

3. Zebrafish fertőzések

A kísérlet időtartama: **** (1-3 óra)

Nehézségi fok: ****

4. A hal előkészítése képalkotásra

A kísérlet időtartama: ** (30 perc)

Nehézségi fok: **

  1. Készítsük el a tricaine-metán-szulfonát-oldatot az előzőek szerint (200 pg/ml). Vegye ki a fertőzött halakat, és vigye át tricaine-ba.
  2. Készítsen 47,9 ml 0,4% -os alacsony olvadáspontú agarózt (Scientific VWR) tojás-vízben. Az oldatot mikrohullámmal melegítjük. Lehűtjük 37 ° C-ra, és metanszulfonát-tricaint (200 pg/ml) adunk az elegyhez
  3. Miután a halakat rögzítettük a metán-tricaine-szulfonátban, pipettázzunk minden halat egy 0,4% alacsony olvadáspontú agarózt tartalmazó Petri-csészébe (VWR Scientific) (VWR Scientific).
  4. Ezután mozgassa az alacsony olvadáspontú agarózhalakat egy üvegfenekű tál (MatTek Corporation) egyes lyukaiba képalkotás céljából. Használjon minél kevesebb agarózt, hogy az megolvadjon, hogy a hal lapos legyen a tál alján. Ne használjon annyi tricaine-agarózt, hogy kitöltse a TNS köröket az üveg alsó lemezén.