A fagyasztott rágcsáló agyi régiók gyűjtése a későbbi elemzések protokollja érdekében (francia nyelvre fordítva)

Összegzés

Ez az eljárás a diszkrét fagyasztott agyi régiók gyűjtését írja le, hogy olcsó és általánosan elérhető eszközökkel kiváló minőségű fehérjét és RNS-t nyerjünk.

Absztrakt

A neurobiológia megértésének előrehaladtával a molekuláris elemzéseket gyakran végezzük az agy kis területein, például a mediális prefrontális kéregben (MPFC) vagy a nucleus accumbensben. Ebben a munkában az a kihívás, hogy a helyes területet boncolgassuk, miközben megőrizzük a vizsgálandó mikrokörnyezetet. Ebben a cikkben egy egyszerű és olcsó módszert írunk le, amely a legtöbb laboratóriumban rendelkezésre álló erőforrásokat használja. Ez a módszer megőrzi a nukleinsavat és a fehérjéket azáltal, hogy a szövetet az egész folyamat során fagyasztva tartja. Az agyakat agyi mátrix segítségével 0,5-1,0 mm-es részekre vágjuk, és egy fagyasztott üveglapra helyezzük. Az egyes szakaszok tereptárgyait összehasonlítják egy referenciával, például az Allen Mouse Brain Atlas-szal, és a régiókat hideg szikével vagy biopsziás lyukasztóval boncolgatják. A szövetet ezután felhasználásig -80 ° C-on tároljuk. Ennek során patkány és egér mPFC-t, a nucleus accumbens-t, a dorzális és a ventralis hippocampust és más régiókat sikeresen elemeztük qRT-PCR és Western-vizsgálatokkal. Ez a módszer az agy olyan területeire korlátozódik, amelyek egyértelmű tereptárgyak alapján azonosíthatók.

Bevezetés

Ez a munka a fagyasztott agyi régiók boncolgatását szemlélteti a kiváló minőségű sav- vagy nukleinsavfehérjék kivonása céljából, referenciaként, például az Allen Mouse Brain Atlas 1 referenciaként. Ebben a technikában az agyakat lefagyasztják és -80 ° C-on tárolják a későbbi metszés és boncolás céljából, miközben fagyasztva tartják őket. Ez a folyamat lehetővé teszi, hogy a kutató nagyszámú agyat gyűjtsön össze egyetlen munkamenetben, és később boncolja fel őket, hogy pontos összegyűjtse az agy több régióját.

A gén- és fehérje expresszióval kapcsolatos kérdések megválaszolásához gyakran szükséges az érdekes agyterületek (ROI) pontos összegyűjtése. Míg a farmakológia, az elektrofiziológia és az optogenetika alkalmazható vad típusú vagy géntechnológiával módosított rágcsálókon, hogy segítsen tisztázni a megfigyelt 2, 3, 4 magatartás alapját képező molekuláris változásokat, a transzkriptómákban és a proteomákban kiváltott változások mérését gyakran alkalmazzák ezen megállapítások alátámasztására., Az olyan technikák, mint a kvantitatív reverz polimeráz láncreakció (RT-qPCR), a Western-puffadás, az RNAseq 5, a MAPSeq 6 és a HPLC 7 robusztusak és viszonylag alacsony költségek, lehetővé téve számos laboratórium számára, hogy "tanulmányozzák a agy 2, 4, 5, 6 .

A fagyasztott szöveten végzett mikropunch boncolás nem új keletű. Palkovits Miklós és mások korai írásai az alapvető technikákat részletesen ismertetik a 14., 15. oldalon. Ez az előadás nagyrészt követi a kezdeti munkát, némi fejlesztéssel a hatékonyság megkönnyítése és a szükséges berendezések költségeinek csökkentése érdekében. Például az agyi szakaszok fagyasztott agyblokkban készülnek, nem pedig kriosztáton. Ez vastagabb szakaszokat eredményez, amelyek csökkentik a ROI minták összegyűjtéséhez szükséges szakaszok számát. Ez a módszer egy fagyasztott üveglemezen is boncolja a mintákat, amely szigetelt dobozban száraz jégen nyugszik. Ez egy padfagyasztási lépést eredményez. Az így boncolt szakaszok könnyen manipulálhatók, lehetővé téve a kutató számára, hogy összehasonlítsa az egyes szakaszok mindkét oldalát egy hivatkozással, hogy korlátozza a régiók szennyezettségét a kívánt beruházás megtérülésén kívül.

Ennek a protokollnak az az előnye, hogy 1) az agyat fagyasztva tartják az egész folyamat során, ami elősegíti a fehérjék és a nukleinsav megőrzését, és időt ad a kutatónak az AI-k gondos gyűjtésére, és 2) a szükséges reagensek olcsók és megtalálhatók a legtöbb molekuláris biológiai laboratórium. Ebben a folyamatban az egész agyakat 0,5-1,0 mm-en metszjük egy agymátrixban, és egy fagyott üveglemezre helyezzük, amelyet folyamatosan száraz jéggel hűtünk. Az Allen Brain Atlas 1-jében vagy más 16, 17 agyatlaszokban található tereptárgyakat használják fel az érdeklődésre számot tartó régiók azonosítására, amelyeket aztán hideg lyukasztóval vagy szikével boncolgatnak. Mivel a szöveteket soha nem olvasztják fel, az így gyűjtött régiók kiváló minőségű RNS-t és fehérjét biztosítanak a későbbi elemzésekhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az ebben a vizsgálatban használt állatokat etikus és humánus módon kezelték, amint azt az Indiana Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (IACUC) és a Nemzeti Útmutató megállapította.

MEGJEGYZÉS: Minden munka megkezdése előtt minden szerszámot és felületet meg kell mosni megfelelő oldószerrel a nukleázok 18 eltávolításához.

1. Agy tárolása

  1. Gyorsan távolítsa el az agyakat az eutanizált felnőtt CD1 vadpapír egerekből, amelyek súlya kb. 30 g, hagyományos módszerrel 13, és a vakut 60 másodpercig fagyassza le folyékony nitrogénben vagy szárazjéggel előre hűtött izopentánban.
  2. A fagyasztott agyat felhasználásig -80 ° C-on, alumíniumfóliában vagy kúpos csövekben tárolja.

2. Az agy mátrixának elkészítése

  1. Huszonnégy órával a szövet boncolása előtt helyezzen el egy tiszta agymátrixot (lásd anyagtáblázat)egy halom megolvasztott fagyasztócsomagoláson. Szendvicsezze be a mátrix oldalait két fagyasztócsomag közé, ügyelve arra, hogy kb. 0,5 cm távolságot hagyjon a borotva rései alja és a gélcsomagok teteje között (1A. Ábra)). Helyezze az alufóliát a végeire a hűtés megkönnyítése érdekében.
    MEGJEGYZÉS: Agymátrix vásárlásakor vásároljon olyan méretűet, amely elég nagy ahhoz, hogy felölelje a boncolandó agy teljes térfogatát.
  2. Helyezze az agymátrixot és a fagyasztócsomagolást tartalmazó dobozt egy -20 ° C-os fagyasztóba úgy, hogy a teteje nyitva legyen egy éjszakán át.

3. Fagyasztott üveglemez elhelyezése