A génexpresszió elemzése smaragd hamufúróban (Agrilus planipennis) kvantitatív valóság felhasználásával

Összegzés

A valós idejű kvantitatív PCR (qRT-PCR) hatékony eszköz az mRNS szintjének diagnosztizálására a különböző rovarszövetekben és fejlődési szakaszokban. Ebben a jelentésben bemutatjuk a qRT-PCR alkalmazását az invazív rovarfajok, smaragd hamufúrók különböző lárvaszöveteinek és fejlődési szakaszainak mRNS-szintjének meghatározására.

Absztrakt

A smaragd hamufúró (EAB, Agrilus planipennis) egy egzotikus invazív kártevő, amely millió kőrisfát (Fraxinus spp) pusztított el Észak-Amerikában. Az EAB továbbra is gyorsan terjed, és a csemetéktől a fákig különböző korú kőrisfákat támad meg. Mindazonáltal a mai napig nagyon kevés vagy egyáltalán nincs molekuláris ismeret az EAB-ról. Arra vagyunk kíváncsiak, hogy megfejtjük a szöveti élettani folyamatok molekuláris alapját, amelyek segítik az EAB-t a kőrisfák sikeres gyarmatosításában. Ebben a jelentésben a kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) hatékony használatát mutatjuk be az mRNS szintjének vizsgálatára a különböző lárva szöveti stádiumokban (beleértve a középbél zsírszövetét és a kutikulát) és a különböző fejlődési szakaszokban (beleértve az 1. St -, 2 Nd -, 3. Rd, 4. instars, prepupák és felnőttek) az EAB-tól. Példaként egy peritrofin gént (itt nevezzük, AP-PERI1) használunk érdeklődésre számot tartó génként, és riboszomális fehérje példát (AP-RP1) használunk belső kontrollként. A peritrofinek a peritrofikus membrán/mátrix (PM) fontos alkotóelemei, amely a rovar belének bélése. A PM-nek különféle funkciói vannak, például emésztés és a középbél hámjának mechanikai védelme.

Jegyzőkönyv

A teljes protokoll az 1. ábra folyamatábra szerinti különböző lépésekkel. A boncolást, az RNS extrakciót, az első szál cDNS szintézisét és a qRT-PCR-t az alábbiakban ismertetjük.

II. RNS extrakció (a gyártó által a Trizol Reagens használatára vonatkozó protokoll szerint)

  1. Az RNS kivonásának megkezdéséhez először használjon műanyag mozsarat, hogy homogenizálja a szöveteket a Trizol-ban 1,5 ml Eppendorf csövekkel. Homogenizálás után az egyes minták teljes térfogatát 1 ml-re állítjuk a Trizol reagenssel.
  2. A fejlődési szakaszban egész állatot folyékony nitrogénben mozsárral és mozsárral homogenizálunk. Ezután adjon a homogenizátum egy alikvot részét (50 ug) 1 ml Trizol-hoz.

  1. Inkubálja a mintacsöveket 1 ml Trizollal 15 percig szobahőmérsékleten.
  2. Inkubálás után minden csőbe adjunk 200 μl kloroformot. A kloroform hozzáadása után azonnal és 15 percig erőteljesen rázzuk a csöveket. Ezután tartsa a csöveket szobahőmérsékleten további 2-3 percig.
  3. Ezután centrifugáljuk a mintákat 12 000 xg-vel 15 percig 2 ° C-on. Centrifugálás után az RNS vizes fázisban van. A vizes fázis térfogatának 600 μl-nek, vagyis a teljes Trizol-térfogat 60% -ának kell lennie.

  1. Óvatosan csak a vizes fázist távolítsa el. Az anyagok jelenléte a vizes fázis alatt szennyezi a kivont RNS-t. Ezután töltsük át a vizes fázist egy megfelelően jelölt 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe.
  2. Az RNS kicsapásához a vizes fázisból keverjünk 0,5 ml izopropil-alkoholt mindegyik csőbe. Inkubálja a mintákat szobahőmérsékleten 10 percig. Inkubálás után centrifugáljuk 12 000 xg-vel 10 percig 2 ° C-on.

  1. Centrifugálás után dobja ki a felülúszót a csövekből. Az RNS a cső alján lévő gélszerű pelletben képződik. Mossuk az üledéket 75% etanollal, legalább 1 ml 75% etanolt adva 1 ml Trizolhoz. Keverjük össze örvényléssel. Ezután centrifugáljuk 7500Xg nyomáson 5 percig, 2 ° C-on.

  1. Dobja ki a felülúszót a csövekből. Centrifugáljuk újra a kis asztali centrifugában 1 percig. Óvatos pipettázással távolítsa el a felesleges felülúszót a csőből. Hagyja nyitva a csövet, és hagyja a pelletet 5-10 percig levegőn száradni. Vigyázzon a száraz pellettel szemben, mivel ez jelentősen csökkenti az oldhatóságát.
  2. Légszárítás után a pelletet dietil-pirokarbonátban vagy DEPC-ben kezelt vízzel kezeljük. A pellet újraszuszpendálásához felhasznált víz mennyisége a pellet méretétől függ. Használjon 50 μl DEPC-vel kezelt vizet egy kis pellethez vagy 100 μl-t egy nagy pellethez. Hagyja a pelletet teljesen feloldódni a DEPC-vel kezelt vízben, a pipetta csúcsának többszöri felfelé és lefelé történő csúsztatásával.
  3. Miután a pellet feloldódott, helyezze a mintát 10 percre 55 ° C-ra.
  4. Ezután mérje meg az egyes RNS minták koncentrációját Nanodrop spektrofotométerrel (2 μl az RNS minta).
  5. Az RNS-mintákat további felhasználásig -80 ° C-on tároljuk.

III. Első szálú cDNS szintézis (a gyártó protokolljának megfelelően, az Invitrogen SuperScript első szálú szintézis készletével).

Alapvető tervezés és a referencia gén meghatározása

    Design alapozó, amelynek olvadási hőmérséklete (Tm) 60 ° C és termékmérete

100 bp.

  • Az AP-PERI1-et használjuk a kísérlet szempontjából érdekes génként. Referencia génre vagy belső kontroll rendszerre van szükség az adatok későbbi elemzéséhez és normalizálásához. Riboszomális fehérjét (AP-RP1) használunk referencia génként ehhez a kísérlethez.
  • Készítsen elő felhasznált alapanyagok 5um működő készletét, beleértve a referencia gént is.

    • A szabványok elkészítése

    1. Az alkalmazott primerek hatékonyságának kiszámításához szabványokat kell készíteni.
    2. Készítsen egy keveréket a különböző tesztelt mintákból a cDNS-ből.
    3. Készítsen 5x soros hígítást a grafikon bármely pontjára. Négy hígításnak elegendőnek kell lennie, de öt nagyon ajánlott.
    4. A kötet attól függően változik, hogy hány pontot és hány technikai másolatot használnak. Elégnek kell lennie ahhoz, hogy minden vizsgált génhez elkészítsenek egy szabványt a megfelelő referencia génnel.

    1. A tervezősablon a minta nevét mutatja a qRT-PCR lemez minden egyes lyukához. Ne feledje, hogy minden génre vonatkoznak szabványok, és mintánként legalább két technikai másolat.

    Állítsa be a kerék paramétereit

    1. Kapcsolja be a qRT-PCR gépet, és írja be a kerék paramétereit. A kísérlet PCR-paraméterei a következők:
      1. lépés:
      • 1 ciklus: 95 ° C 3 perc
      2. lépés:
      • 40 ciklus: 95 ° C 15 mp, majd 60 ° C 30 mp
        (Opcionális: az olvadási görbe meghatározásához kövesse az alábbi lépéseket)
      3. lépés:
      • 1 ciklus: 95 ° C, 1 perc
      4. lépés:
      • 1 ciklus: 55 ° C, 1 perc
      5. lépés:
      • 81 ciklus: 55 ° C 30 sec

    Helyezze fel a lemezt a CFX96 (BioRad) géphez

    V. A kísérlet sematikus ábrázolása

    elemzése
    1. ábra: Folyamatábra, amely bemutatja a génexpresszió vizsgálatának lépéseit.

    hamufúróban
    2. ábra: A) A lárva EAB boncolásán a középbél látható. B) az EAB lárvák izolált közepe

    génexpresszió
    3. ábra: A) Egy peritrofin gén (AP-PERI1) átlagos relatív expressziós értéke (fordulat) a különböző lárva szöveti stádiumokban, beleértve a kutikulát (Cu), a középbelet (MG) és a zsír testet (FB). EAB-specifikus riboszomális fehérjét (itt nevezzük meg, AP-RP1) alkalmaztunk belső kontrollként az érdeklődésre számot tartó gén, az AP-PERI1 normalizálására. B) Az AP-PERI1 relatív hajtásváltozása a lárva szövetében. A kutikulaszövet mutatta a legkevesebb kifejeződést, ezért kalibrátor (1X) mintaként alkalmazták (Pfaffl, 2001).

    génexpresszió
    4. ábra: A) Egy peritrofin gén (AP-PERI1) átlagos relatív expressziós értéke (fordulat) az EAB különböző fejlődési szakaszaiban, beleértve a lárva stádiumokat (1., 2., 3. és 4.), a prepupákat (PP) és a felnőtteket (A). EAB-ban meghatározott riboszomális fehérjét (AP-RP1) használtunk belső kontrollként az érdeklődésre számot tartó gén, az AP-PERI1 normalizálására. B) Az AP-PERI1 relatív változásai a fejlődés különböző szakaszaiban. A PP mintán az mRNS szintje volt a legalacsonyabb, ezért kalibrátornak vették (1x minta).

    A valós idejű kvantitatív PCR (qRT-PCR) hatékony eszköz az mRNS szintjének diagnosztizálására a különböző rovarszövetekben és fejlődési szakaszokban. Továbbá, a qRT-PCR általában az a központi eszköz, amely a nagy áteresztőképességű génexpressziós analízisekkel, például a mikro-sugarakkal és az új RNS-Seq.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Vita

    Az egyes minták küszöbérték-ciklusainak (Ct) értékét a qRT-PCR lemezen kapjuk meg. A standard görbe előállításához az egyes hígításokhoz kapott Ct-értéket a koncentráció log-jához viszonyítva ábrázoltuk. A kísérleti minták Ct értékeit ezután ábrázoltuk ezen a standard görbe hígítási sorozaton. A célmennyiségeket minden kísérlethez külön standard görbékből számoltuk, azaz szöveti és fejlődési expresszió keletkezik. Ezután a relatív expressziós értékeket (fordulatszámokat) úgy határoztuk meg, hogy a kívánt célszekvencia (jelen esetben AP-PERI1) mennyiségét elosztottuk a belső kontrollrendszerhez (AP-RP1) kapott mennyiséggel. A számítások szempontjából lényeges, hogy az egyes gének REV-jének naplóit ANOVA-val (varianciaanalízis) elemeztük az SAS PROC MIXED eljárásával (SAS Institute Inc. SAS/STAT Felhasználói kézikönyv, 9.1 változat). A kifejezés jelentését a p Subscription-ben kellett megadni. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Közzétételek

    Nem jelentettek be összeférhetetlenséget.

    Köszönetnyilvánítás

    Elismerjük Lourdes Delta Arrueta Antequera (Entomológiai Tanszék, Ohio Állami Egyetem/OARDC, Wooster, OH) segítségét a kísérletek felállításában. Köszönjük Dr. Therese Poland (USDA, Forest Services, NRS) az EAB lárvaminták küldéséért. Segítséget Dr. Luis A Canas és Nuris M Acosta a mikroszkóp beállításával értékelik. A projekt finanszírozását az Ohio Állami Egyetem Ohio Mezőgazdasági Kutató és Fejlesztő Központja által biztosított állami és szövetségi alapokból szerezték.