A génexpresszió funkcionális szerepének megkülönböztetése az egér immun- és nem-immunsejtjeitől

Összegzés

A csontvelő-transzplantáció lehetőséget nyújt a csontvelőből származó sejtek genotípusának megváltoztatására. Ha az érdekes gént mind a csontvelőből származó, mind a nem csontvelőből származó sejtekben expresszálják, a csontvelő-transzplantáció megváltoztathatja a csontvelőből származó sejteket egy másik genotípusra anélkül, hogy genotipizálná a nem csontvelőből származó sejteket.

Absztrakt

Jegyzőkönyv

A. Műszaki szempontok az indulás előtt

* A vizsgálati protokoll rövid leírása itt található 1. ábra Látható.

2. Vevő egerek besugárzása

  1. Az egereket tenyésztik és kórokozóban tartják. Helyezze az egereket autoklávozott besugárzási pite szűrőkkel. Helyezzen egy egeret a besugárzási pite minden egyes nyílásába. Helyezze a süteményt a reflektorfénybe, és ellenőrizze, hogy a forgótányér és a torta megfordul-e.
  2. Kapcsolja be a légszivattyút a szellőzés érdekében. Csukja be a fűtőajtót és zárja be.
  3. Besugározzuk az egereket 1000 rad-tal (ami egyenértékű 10 Gy-vel) körülbelül 10 percig (a sugárforrástól és a felezési időtől függően). Ettől kezdve a besugárzott egerek immunhiányosak és gyenge a fertőzéssel szembeni immunitás. Besugárzás után vegye ki a süteményt, és helyezze egy steril tartályba az állatok biológiai biztonsági szekrényéhez való szállításhoz. Kerülje az egerek külső környezetbe juttatását a fertőzés esélyének minimalizálása érdekében.
  4. A biológiai biztonsági szekrényben vigye az egereket autoklávozott egerekbe, autoklávozott ágyakkal (4 egér ketrecben. Új steril víz szulfatrim szuszpenzióval - 3,12 ml/100 ml víz).
  5. Csavarja be a kulacsot alufóliával, mivel az antibiotikumok érzékenyek a fényre. Alaposan rázza meg a szulfatrim palackot, mielőtt beteszi a ketrecbe.

3. A donor csontvelőjének kivonása

4. A csontvelő donorsejtek számlálása

  1. Adjunk hozzá 100 μl tripánkéket egy Eppendorf-csőbe és 100 μl a csontvelő-szuszpenziót egy Eppendorf-csőbe, és keverjük össze. Pipettázza a festett sejtkeveréket egy számláló kamrára.
  2. A sejtek mennyiségét a Falcon-csőben lévő csontvelő sejtszámának teljes életterületéből számoljuk ki = festetlen sejtszám 16 négyzetben x 2 (tripán kék hígítás miatt) x 10 000 x 50 ml
  3. Centrifugáljuk a csontvelő sejteket 50 ml Falcon csövekben, 2000 fordulat/perc sebességgel, 5 percig, 4 ° C-on.
  4. Távolítsa el a felülúszót. Az összes sejtszám alapján méretezze át az üledéket PBS-sel 1 x 108 sejt/ml-re

5. A befogadó egerek infúziója

  1. Melegítse a befogadó egereket egy fűtőtesten és egy hőforrás alatt. Helyezze a befogadó egereket korlátozóba. Egérenként 1 × 107 sejt 100-200 μl intravénásan.
  2. A donor csontvelőjének injekcióját a besugárzás után 4-24 óra között kell elvégezni.
  3. Ragaszkodjon 4 injektált egérhez ketrecenként. Az injektált befogadó egereket az első 4 hétben antibiotikummal kezelt vízzel autoklávozott ketrecekben tartjuk kórokozóktól mentes állattartásban, és hagyjuk, hogy az egerek visszanyerjék az immunitást. A higiénia megőrzése érdekében 4 naponta cserélje a ketreceket, az antibiotikumokkal kezelt vizet és az ételt.

6. A vastagbélgyulladás kiváltása és a vastagbélgyulladás értékelése

7. A csontvelő transzplantáció minőségi ellenőrzése áramlási citometriával

  1. Jelölje meg az 1–5. Számú vér- vagy csontvelő-mintacsövet:
  2. Készítse elő az antitest-keveréket minden egyes csőhöz sötétben.

# 1 Nincs antitest
# 2 30 µl FITC izotípus kontroll + 30 µl PE izotípus kontroll + 15 µl CD16/32 blokkolás
# 3 30 µl FITC CD45.1 Ab + 15 µl CD16/32 blokkolás
# 4 30 µl PECD45.2 Ab + 15 µl CD16/32 blokkolás
# 5 30 µl FITC CD45.1 Ab + 30 µl PE CD45.2 Ab + 15 µl CD16/32 blokkolás

Ne adjon semmit az 1. számú vér- vagy csontvelőmintához
Adjon 5 μl 2. antitestkeveréket minden 2. vér- vagy csontvelőmintához
Adjon 3 μl 3. antitestkeveréket minden egyes 3. vér- vagy csontvelőmintához
Adjon 3 μl # 4 antitestkeveréket minden egyes 4. vér- vagy csontvelőmintához
Adjon 5 μl # 5 antitestkeveréket minden egyes 5. vér- vagy csontvelőmintához
  1. Tartsa sötétben jégben 30 percig.
  2. 2 ml 1x vörösvérsejt-lizáló puffert minden csőben. Tartsa sötétben jégen 15 percig.
  3. Centrifugáljuk a sejteket 1500 fordulat/perc sebességgel, 5 percig 4 ° C-on (GH 3,8 rotor, 1500 fordulat/perc = 350 xg) Távolítsuk el a felülúszót. A pelletet 500 μl sejtfestő pufferrel sötétben, majd röviden vortexeljük.
  4. Ellenőrizze a CD45.1-et (egyenértékű a WT-vel) és a CD45.2-t (KO) az immunfestett vér- és csontvelő-mintákban áramlási citometriával. Válassza az FITC lehetőséget a WT CD45.1, a PE pedig a KO CD45.2 jelölését.
  5. A FlowJo szoftver segítségével elemezze az áramlási citometria eredményeit. Számítsa ki a FITC: PE arány vagy a PE: FITC arányt annak meghatározásához, hogy a donor genotípusának domináns genotípusai vannak-e a vérben és a csontvelőben.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Ha a kérdéses génnek jelentős szerepe van az immunsejtekben a vastagbélgyulladás kialakulásában, akkor a csontvelő-átültetés során különböző genotípusú csontvelőt kapó egereknek (WT KO vagy KO-tól WT-ig) megváltozott válaszuk kell a DSS colitisre. A vastagbélgyulladás súlyosságának meghatározásakor az egyik legfontosabb paraméter a vastagbélszövetek H&E festése. A vastagbél szövetének változásai és a gyulladás jelei kvantitatív módon értékelhetők a H&E szövettani pontozási rendszer segítségével. A DSS Colitis modell H & E szövettani pontozásának kritériumai itt találhatók 2. Alternatív megoldásként kémiai indukált vastagbélgyulladást indukálhat a trinitrobenzolszulfonsav (TNBS) is. A TNBS vastagbélgyulladás indukciójának és a H&E szövettani értékelési kritériumai egy korábbi publikációban találhatók 3. Szövettani pontszám különbség a csoportok között, hallgatói t-tesztekkel elemezve.

Ál-csontvelő-transzplantációval (WT WT vagy KO KO) szenvedő egereknél az egerek jelentősen túlzottan javultak vagy súlyosbodhatnak. Ha a kérdéses gén a csontvelőből származó sejteken keresztül jelentős szerepet játszik a vastagbélgyulladásban, akkor a kicserélt csontvelővel rendelkező egereknek szignifikánsan másképp kell reagálniuk, mint az álcsontvelő-átültetett egereknek.

A DSS vastagbélgyulladás modell esetében a szövettani változás szövettani pontozással értékelhető (lásd 4. ábra). A szövettani pontszám jelentős változása azt jelezheti, hogy a csontvelőből származó sejtekben az érdekes gén közvetíti a vastagbélgyulladást. Például a cathelizidin antimikrobiális és gyulladáscsökkentő peptid gén (esetünkben érdekes gén) 4. Csontvelő-transzplantáció nélkül a katelicidin knockout egereknél általában rosszabb vastagbélgyulladás alakult ki, mint a vad típusú egerekben DSS-re válaszul. A vad típusú (WT) csontvelő katelicidin knockout (KO) egerek transzfúziója javított vastagbélgyulladáshoz vezet, míg a csontvelő transzfúziója a katelicidin knockout (KO) egerekből a vad típusú (WT) egerekhez súlyosbodott vastagbélgyulladáshoz vezet, amikor a DSS (2. ábra) kitett.

Az érdeklődésre számot tartó gén expressziójának megerősítéséhez a csontvelő-átültetés után a donor vad típusú csontvelőből származó, a donor vad típusú csontvelőből származó mRNS-expressziónak a katelizidinhiányos knockout recipiens egerek vastagbél (vagy más) szövetében kimutathatónak kell lennie. Érdekes tudni azt is, hogy a vad típusú recipiens egerekben az érdekes gén expressziója csökkentette-e a csontvelőt a knockout egerek adományozása után.

A sikeres donor csontvelő-transzplantációt a donor CD-izotípusának domináns aránya jelenti a befogadó CD-izotípushoz viszonyítva mind a perifériás vérsejtekben, mind a befogadó egerek csontvelőjében. A csontvelő mutatja legjobban a CD45.1 és CD45.2 jelölését az áramlási citometriában, mivel a vérben sok a nem festett sejt (2. és 3. ábra).

egér
1. ábra: A kísérleti csontvelő-transzplantációs protokoll.

egér
2. ábra: A csontvelő transzplantáció után a csontvelő befogadó egerek áramlási citometriájának adatai. Az Y tengelyen a FITC jelzéssel ellátott CD45.1 jel, az X tengelyen a PE jelzéssel ellátott CD45.2 jel látható. A sikeres csontátültetést a CD45.1 vagy CD45.2 genotípus változása határozza meg a befogadó egerek csontvelőjében és vérében egyaránt. Kattintson ide a nagyobb kép megtekintéséhez .

funkcionális
3. ábra: A befogadó véres egerek áramlási citometriájának adatai a csontvelő-transzplantáció után. Az Y tengelyen a FITC jelzéssel ellátott CD45.1 jel, az X tengelyen a PE jelzéssel ellátott CD45.2 jel látható. A sikeres csontátültetést a CD45.1 vagy CD45.2 genotípus változása határozza meg a befogadó egerek csontvelőjében és vérében egyaránt. Kattintson ide a nagyobb kép megtekintéséhez .

szerepének
4. ábra A vastagbélgyulladás értékelése egerekben a csontvelő-transzplantáció után. (A) A vastagbél H&E képei a normál szövettan és a DSS vastagbélgyulladás miatt. (B) Szövettani pontszámok. A DSS vastagbélgyulladás sikeres indukciója megerősíthető a szövettani pontszám jelentős növelésével a DSS kezelés 5. napjáig. A csontvelő különböző genotípusra cseréje után a szövettani pontszámnak jelentősen meg kell változnia. Ez arra utal, hogy megváltozott a vastagbélgyulladás, amelyet az érdeklődésre számot tartó gén expresszálása okoz a csontvelőből származó sejtekben. Az adatok az átlag ± az átlag szórása.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Ez a csontvelő-transzplantációs megközelítés alkalmas colitis, fertőzések, rák, elhízás és más betegségek immunológiai kutatására. Erre a csontvelő-átültetési kísérletre akkor van szükség, ha az érdekes gén mind a csontvelőben, mind a nem csontvelőből származó sejtekben kifejeződik, és feltételezhető, hogy az érdekes gén bármely populáció sejtjei közvetítik a betegséget. Például kimutatták, hogy a katelizidin antimikrobiális peptid modulálja az akut vastagbélgyulladást. De mind a hámsejtekben, mind az immunsejtekben (makrofágokban) kifejeződik. Ezután csontgraftokkal határozzuk meg, hogy mely sejtpopuláció modulálja az egerekben az akut vastagbélgyulladást. A vastagbélgyulladás súlyossága jelentősen megváltozott a csontvelő katelizidin genotípusának csontvelő transzplantációval történő megváltoztatása után. Ezután arra a következtetésre juthatunk, hogy a csontvelőből származó sejtekben expresszált katelizidin jelentős szerepet játszik az akut vastagbélgyulladás modulálásában, válaszul a DSS-re.

Másrészt sokféleképpen követhető nyomon a csontvelő-átültetés sikere. A CD45.1 és CD45.2 genotípusok áramlási citometriájának elemzése kvantitatív módszer lehet a donor csontvelőből származó őssejtek arányának meghatározására a befogadó egerekben. A csontvelőből származó sejtek többféle sejtre differenciálhatók 10. Ha az áramlási citometriás elemzés nem lehetséges, akkor lehetőség van hím (XY kromoszóma) donor egerek és nőstény (XX kromoszóma) recipiens egerek felhasználására 11. A donor egerek egyedülálló Y kromoszómákat hordoznak az egyetlen befogadó nőstény nőstény egerek testében. Az Y kromoszóma fluoreszcencia in situ hibridizációval azonosítható 11. Ezenkívül szükség lehet a CD45.1, CD45.2 és/vagy a szövetekben érdekes gének immunhisztokémiájára a donor csontvelőből származó sejtek megjelenítéséhez.

De a CD45 áramlási citometriás elemzést és az Y kromoszóma in situ hibridizációs eljárásokat általában az egerek leölése után hajtják végre. Annak érdekében, hogy ellenőrizzük a donorsejtek helyzetét a krónikus betegségek, például a rák megfigyelésére használt befogadó egerekben anélkül, hogy a vizsgált egereket elvégeznénk, donor egerekként zöld fluoreszcens fehérje transzgénikus egereket is alkalmazhatunk. Ezért a donor csontsejtből származó sejtek nem invazív, nagy felbontású optikai képalkotással, tranziens anesztézia alatt vezethetők be a befogadó egerek testébe, és ez ismételten elvégezhető.

Nem minden egernek sikerül a csontvelő-transzplantációja 13. Megfigyeltük,

Az egerek 10-20% -a hal meg vérszegénységben vagy fertőzésben a besugárzást követő első 2 hétben. Ezért a szükségesnél több egeret kell készíteni a kísérlet kezdetén. Például a kísérlet kezdetén csoportonként 10 egeret kell készítenie, ha a colitis kísérlet végéig csoportonként 8 egeret vár. Tehát ügyeljen arra, hogy mielőbb távolítsa el az elhalt egereket. Az immunrekonstrukció sebessége korrelál a befogadó egerekbe infundált csontvelőben lévő hematopoietikus őssejtek számával. Ezért kritikus fontosságú, hogy elegendő számú élő csontvelő sejtet (egérenként 1 x 107 sejt) adunk be a befogadó egereknek a sikeres csontvelő-transzplantáció érdekében.

A befogadó egerek a besugárzás után az immunitás sérültek. A donor egerek boncolását és a csontvelő előkészítését ugyanazon szabvány szerint kell elvégezni, mint a sejttenyésztési kísérleteket. Aszeptikus feltételeket steril eszközök és tartályok alkalmazásával kell alkalmazni. Minden kísérletben a PBS 1% penicillin-sztreptomicint tartalmaz, és 10 U/ml heparint kell használni a kerti tök csontjainak kezelésénél. Minden reagens a sejttenyésztésre szolgál. További technikai megbeszélések a 13. hivatkozásban találhatók.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

Nem jelentettek be összeférhetetlenséget.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az UCLA-CURE Center, a Crohn-féle Betegség és Colitis Alapítvány Amerikai Karrierfejlesztési Díjának (# 2691) és az Országos Egészségügyi Intézet NIDDK K01 (DK084256) támogatásával finanszírozták Hon Wai Koon finanszírozásához.

A csontvelői besugárzási műtétet Bernard Levin és Scott Kitchen támogatta az UCLA AIDS Kutatóközpont Egér/Emberi Kiméra Alap Létesítményéből. Az áramlási citometriát az UCLA Vector Core létesítménye támogatta.