A leptin rezisztencia megelőzése az angiotenzin II (AT 1) receptorok blokkolásával a keretben
1 A Lübecki Egyetem Kísérleti és Klinikai Farmakológiai és Toxikológiai Intézetéből igazgató: Prof. Dr. med. Markus Schwaninger A leptinrezisztencia megelőzése az angiotenzin II (AT 1) receptorok blokkolásával patkányok étrend által kiváltott elhízása kapcsán. Nyitó disszertáció doktori cím megszerzéséhez a Lübecki Egyetemen - az Orvostudomány részlegből - Margot Lau, Thermann, Lübeck Lübeck 2012
2 1. riporter: Prof. Dr. rer. nat. Walter Raasch 2. riporter: Prof. Dr. med. D. Ludwig 3. Előadó: Prof. Dr. med. P. Gohlke A szóbeli vizsga napja: Nyomtatásra jóváhagyva: Lübeck, az orvostudományi szekció doktori bizottsága
3 - Kedves szüleimnek-
4 Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék Bevezetés Inzulinrezisztencia Elhízás Renin-Angiotenzin-Aldosterone-System (RAAS) Anyag és módszerek Tesztprotokollok Kísérleti állatok Leptin-érzékenység vizsgálata telmisartán alatt Glükóz tolerancia vizsgálata hosszú távú táplálkozás során cafeteria diétával Oldatok készítése Inzulin oldat Leptin oldat vagy gyógyszeroldat Telmisartan alkalmazása Anyagok Intraperitoneális alkalmazás Szájon át történő alkalmazás Szubkután alkalmazás Anyagkitermelés Antikoagulánsok és stabilizátorok Vérvétel a farokból Gyilkolás és szerveltávolítás Funkciótesztek Pletiszmografikus vérnyomásmérés Aktivitásmérés Leptin rezisztencia teszt Orális glükóz tolerancia teszt (OGTT)
5 Tartalom-jegyzék Inzulin tolerancia teszt (ITT) Biokémiai analízis Radioimmunoassay (RIA) Hipotalam előkészítése Az mrna mrna kvantifikációs cdna szintézisének kivonása Kvantitatív valós idejű PCR Western blot számítások és statisztikai módszerek Eredmények A leptin rezisztencia teszt Leptin kinetikájának megállapítása egyetlen LRC teszt alkalmazásával (LRT leptin rezisztencia teszt) ) A telmisartan hatása a leptin érzékenységére A telmisartan kezelés hatása a testsúlyra és az energia bevitelre A telmisartan kezelés hatása a plazmaleptinre A telmisartan kezelés hatása az energiafogyasztásra A telmisartan kezelés hatása a hemodinamikára Telmisartan alatt A glükóz tolerancia vizsgálata hosszú távú táplálkozás során cafeteria diétával A cafeteria diéta hatása a testsúlyra Élelmiszer- és vízfogyasztás cafeteria diéta alatt Fizikai aktivitás A cafeteria diéta hatása a hemodinamikára A cafeteria diéta hatása az alapvető metabolikus paraméterekre Orális glükóz tolerancia teszt (OGTT) Inzulin tolerancia teszt (ITT) A cafeteria diéta hatása a túlélésre
6 Tartalom 4 Megbeszélés Az AT 1 blokkolásának telmizartánnal gyakorolt hatása a leptin érzékenységre Tesztkészletek RIA készletek Készletek a génexpresszió meghatározásához Fogyóeszközök Készülékek Rövidítések listája Köszönetnyilvánítás Önéletrajz Publikációk Poszter Publikációk Díjak és kitüntetések
22 Anyag és módszer: kontrollként 8 mg/kg/nap vagy vizet (H20) kezeltek. Minden patkány választhatott a cafeteria étrend és a standard étrend között. Tíz napos ismerkedési fázis után a patkányokat négy csoportba soroltuk (n = 10): TEL/Lep-kezelt SD (n = 10) TEL-kezelt SD (n = 26) TEL/NaCl-kezelt SD (n = 10) TEL kezelt SD (n = 6): vérnyomás H 2 O-val kezelt SD (n = 20) H 2 O/Lep-kezelt SD (n = 10) H 2 O/NaCl-val kezelt SD (n = 10) 3. ábra: Kezelési rend a leptin érzékenységének meghatározására telmisartán (TEL) vagy kontroll (H 2 O) alatt, egyidejű táplálással cafeteria diétával. Az utolsó leptinrezisztencia-tesztben a Sprague-Dawley patkányok (SD) szubkután injekcióban leptint (Lep) vagy fiziológiás sóoldatot (NaCl) kaptak. A vizsgálat végén elvégzett komplex leptin-rezisztencia teszt miatt az állatokat egy héttel eltolva szállítottuk, így csak 20 állományt randomizáltunk a négy csoportba (n = 5), és a vizsgálati protokollt analóg módon, egy héttel eltolva végezhettük el (4. ábra).
25 Anyag és módszerek 2.2 Oldatok készítése Inzulinoldat 40 NE/ml dózisú humán inzulint (Insuman Rapid) 1:80 arányban 0,9% NaCl-oldattal hígítottunk úgy, hogy 0,5 NE/ml 0,5 NE/testtömeg-kg intraperitoneálisan injektálható Leptin-oldat A Leptin-t (R&D Systems, rekombináns patkányleptin, tisztaság> 97%) feloldottuk 20 mm-es TRIS (tris (hidroxi-metil) -amino-metán) pufferben (pH 8) és 100 vagy 200 µg/ml koncentrációra hígítottuk. Erre a célra kezdetben a Tris puffert használták. A megfelelő mennyiségű triszt megmérjük desztillált vízben. feloldjuk, 5 N NaOH-val a kívánt pH-értékre pufferoljuk, és desztillált vízzel a kívánt térfogatra beállítjuk. feltöltve. A kész oldatot sterilen szűrjük Telmisartan oldat A telmisartan oldatot (Boehringer, Ingelheim) 8 mg/ml koncentrációban állítjuk elő. Az információ 10 ml törzsoldatra vonatkozik. A telmizartánport megfelelő mennyiségben lemérjük és teljesen feloldjuk 2 ml 0,1 N NaOH-oldatban. 6 ml desztillált víz. pipettával adtuk hozzá és 0,1 N sósavoldattal titráltuk 8,8 és 9,2 közötti pH-tartományban. Végül aqua dest. 10 ml-re töltjük
26 Anyag és módszer 2.3 Gyógyszerek vagy anyagok alkalmazása Intraperitoneális alkalmazás Az inzulint intraperitoneálisan (kanül 0,4 x 13 mm, BD Microlance) 0,5 NE/kg dózisban adtuk be. Orális alkalmazás A folyadékok orális beadása történt garaton keresztül, amelyet az állatok beszoktatása után a nyelőcsőbe illesztettek. 50% -os glükózt és telmizartánt 8 mg/kg dózisban adtak be szájon át Szubkután alkalmazás A leptint 100 és 200 µg/kg dózisban injektálták a szubkután zsírszövet mediálisába a lapockához egy erre a célra felállított bőrredőbe (kanül 0,4 x 13 mm)., BD Microlance). 2.4 Anyag extrakció Antikoagulánsok és stabilizátorok A leptin, az inzulin, a C-peptid, a glukagon, az adiponektin és a kortikoszteron paramétereit a plazmából határoztuk meg K-EDTA-val bevont mikrotartókban (Sarstedt). 12,1 mm végkoncentrációjú Na-EDTA-oldatot adunk a vágóvérhez, hogy megvizsgáljuk a leptint a plazmában