A mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik a kísérleti krónikus folyamat során

1 Mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik a kísérleti krónikus hasnyálmirigy-gyulladás során.

kísérleti

2 Mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik a kísérleti krónikus hasnyálmirigy-gyulladás során. urna: nbn: de: gbv: 28-dissz

4 1 Bevezetés és kérdések Bevezetés Anyagkitermelés Hasnyálmirigy-megbetegedések Akut hasnyálmirigy-gyulladás Krónikus hasnyálmirigy-gyulladás A hasnyálmirigy-gyulladás állatmodelljei Az akut hasnyálmirigy-gyulladás modelljei Az akut hasnyálmirigy-gyulladás modelljei Cerulein-hasnyálmirigy-gyulladás alacsony kolin tartalmú étrend transzformációs növekedési faktorból - a hasnyálmirigyben a transzgénikus egérben A transzformáló növekedési faktor túlzott expressziója - a hasnyálmirigyben a transzgénikus egérben Transzgenikus egér a TGF II típusú receptor domináns-negatív mutánsával Trinitrobenzol-szulfonsav (TNBS) indukálta hasnyálmirigy krónikus kísérleti pancreatitis által kiváltott Dibutil-ón-diklorid hasnyálmirigy-csillagképző sejtek mátrix metalloproteinázok és mátrix metalloproteináz fibrózis, hasnyálmirigy stellátum sejtek és mátrix metalloproteinázok szöveti inhibitorai 16 2 Anyag és módszerek Anyag Vegyszerek DNS oligonukleotidok pufferek és oldatok baktériumtenyésztő közeg készletek laboratóriumi állatok fogyóeszközök krónikus DBTC hasnyálmirigy-gyulladás kiváltása 21 1

5 2.3 RNS extrakció a hasnyálmirigyből Az mrna-expressziós kontroll fragmens kimutatása A baktériumok plazmid DNS-amplifikációja Nukleinsavak mennyiségi meghatározása RNS elektroforézis Fordított transzkriptáz Versenyképes polimeráz Láncreakció A PCR-termékek elektroforézise és a fluoreszcencia-analízis A hasnyálmirigy-stellát sejtek előállítása A hasnyálmirigy-stellát sejtek PCR-je Zymográfiai mintavétel gél felrakása és elektroforézis elvégzése, valamint a hematoxylin és eozin festés értékelése 32 3 Eredmények A DBTC pancreatitis szövettana A cdna beállítása a mátrix metalloproteinázok -aktin expressziójával az MMP-2 MMP expressziójának szöveti expressziójában és a szövet mátrix metalloproteinase szöveti inhibitorának MMP expressziójában A TIMP expressziója A TIMP MMP expressziója hasnyálmirigy stellate sejtekben Statisztika 41 4 Megbeszélés A DBTC pancreatitis MMP MMP-9 lefolyása leukocitákból kapcsolat Az bazális membrán és az MMP-9 MMP szintézisének kapcsolata PSC RNS expresszióban az MMP-9-ről krónikus DBTC pancreatitisben MMP-2, MMP-3, TIMP-1 és TIMP-2 RNS expressziója krónikus DBTC pancreatitisben Következtetések 47 2

6 5 tézisek 48 6 rövidítések listája 51 7 irodalom 52 8 elismerés 66 9 függetlenségi nyilatkozat 67 3

16 1. ábra: Sejtfunkciók proteolitikusan aktív MMP-k hatására. (A) Az ECM lebomlása és a sejtvándorlás. (B) proliferáció vagy apoptózis indukciója. (C) A mediátorok és receptoraik modulálása. (D) További proteázok aktiválása proenzimjeik vagy inhibitoraik lehasításával (Vu és Werb, 2000). 3 A mátrix metalloproteinázok több mint 20 ismert cinkfüggő proteáz csoportja. Ezek képesek lebontani az extracelluláris mátrix lényeges összetevőit, például a kollagént, a laminint, a fibronektint vagy az elasztint. Különböző doménekből álló struktúrájuk miatt az MMP-ket négy csoportra lehet felosztani: matrilizin, hemopexin-szerű doménekkel rendelkező MMP-k, transzmembrán doménekkel rendelkező MMP-k, fibronektin-szerű doménekkel rendelkező MMP-k. Valamennyi MMP rendelkezik a szekrécióhoz szükséges régióval, látens állapotban van és katalitikus régióval rendelkezik, amely az aktív cinkkötő helyet tartalmazza. 53 Az MMP-k osztályozása azonban családokra osztáson alapul, amelyek összefoglalják az MMP-k szubsztrátjait (1. táblázat).

18 Ez vonatkozik a proenzimekre is. A specifik átfedését a TIMP-1 és a TIMP-2 50% -os szekvenciahomológiája magyarázza. A kapott MMP aktivitás a szövetben lévő MMP és TIMP arányától függ. Ennek az egyensúlynak a változásai vagy az MMP szignifikánsan megnövekedett proteolízis aktivitásához vezetnek, vagy a fibrogenezishez. 60 Név TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 Funkció Gátolja a Pro-MMP-9 és más aktív MMP-ket Gátolja a Pro-MMP-2 és az aktív MMP-2-et Nincs meghatározva Nincs meghatározva Nincs meghatározva 2. táblázat: Mátrix metalloproteinázok szöveti inhibitorai ( TIMP-k) és funkcióik 2. ábra: A mátrix metalloproteinázok katepszinnel és plazminnal történő aktiválásának kaszkádja. A Pro MMP-k automatikus aktiválása aktív MMP-kkel és MT MMP-vel 1. A mátrix lebontásának gátlása TIMP-ek által. (Evans et al. 1999) 61 15

22 TIMP 2 amplikon hossza: 453 bp TIMP 2 antiszensz CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA hossza: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA hossza 23 bp pqr2 és pqr3 vektor Graham M.A. Wells, Neures Limited, Egyesült Királyság Pufferek és oldatok Comassie Blue solution DBTC solution DEPC- H 2 O 1 rész jégecet (50 ml) 3 rész izopropanol (150 ml) 6 rész H2O (300 ml) 0,25 g Comassie Blue-t adjon 100 ml-re (1,25 g). . Oldjuk fel a DBTC-t 96% -os etanollal két részben. Ezután keverje össze három rész glicerinnel. Inkubálja 1 liter dh20-t 1% DEPC-vel egy éjszakán át. Ezután deaktiválja a DEPC-t autoklávozással. Eozin 2,5 g eozin (színindexszám) 500 ml H 2 O HBSS + FCS Mayers Hematoxylin PBS (foszfátpuffer sóoldat) poliakrilamid elektroforézis puffer 50 ml HBSS és 15 ml FCS 4%, helyezzük jégre. Az alábbiakat feloldjuk 750 ml vízben: 50 g alumínium-szulfát (KAl (SO 4) 2 12H 2 O) 1 g hematoxilin (színindex-szám) 0,1 g nátrium-jodit (NaIO 3) 1,0 g citromsav 50 g klórhidrát Ad H 2 O 1000 ml-ig 120 mM NaCl 170 mm-ig NaH 2 PO 4 3 mm KCl 26 mm KH 2 PO 4, ph 7,2 3,03 g (0,025 M) Tris 14,1 g (0,152 M) glicin 1,0 g (0,1%) SDS 1000 ml-re H20-val töltve. P1 puffer, Qiagen 50 mM Tris ph mM EDTA Rnase A (400 μg/ml) P2 puffer, Qiagen 200 mM NaOH 1% SDS puffer, Qiagen 2,55 M KAc ph 4,8 puffer, Qiagen 750 mM NaCl 50 mM MOPS 15% etanol ph

23 puffer QC, Qiagen puffer QF, Qiagen Stop oldat szubsztrátum puffer TAE puffer 1 L 1 M NaCl 50 mM MOPS 15% etanol Ph M NaCl 50 mM MOPS 15% etanol ph mg Narancs G 2,5 g Ficoll 400 EDTA 0,5 M 50 mmol/l Tris ph8 + 5 mmol/l CaCl2 242 g Tris 57 ml ecetsav 96% 100 ml EDTA 0,5 M ph8 - 1000 ml H20 kettős diszt. Tris-puffer Tris-HCl 1 M DEPC-H20-ban, pH 7,4 Triton-oldat 2,5% 10 ml Triton + 490 ml H20 O Baktériumtenyész baktérium törzsként a Gibco BRL (Eggenstein, Németország) Escherichia coli DH5 törzsét használtuk. A baktériumok szaporításához szükséges táptalajt a Difco Laboratories-től (Detroit, USA) szereztük be. Ampicillin LB agarlemezek Adjunk 100 mg/l ampicillint az LB agarlemezekhez. LB agarlemezek Luria Bertani (LB) - közepes 5 g élesztő kivonat 10 g triptikus pepton 10 g NaCl aqua dest. 15 g agar H 2O redisztál 1 l-re 5 g élesztő kivonat 10 g triptikus pepton 10 g NaCl aqua dest. A pH-t 7,4-re állítjuk, a H 2O-t újra redisztáljuk 1 N NaOH-val. 1 l transzformációs pufferhez 10% (wt/vol) polietilén-glikol mM MgCl 2 LB-közepes készletekben Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Németország Qiagen, Hilden, Németország Qiagen, Hilden, Németország Qiagen, Hilden, Németország 20