A nanorészecskék felületi funkcionalizálása a biomolekulákkal történő célzott interakció érdekében - PDF
1 A nanorészecskék felületi funkcionalizálása biomolekulákkal történő célzott interakció céljából Értekezés a természettudományok doktorának (Dr. rer. Nat.) Tudományos fokozatának megszerzéséhez Beadva a Berlini Szabadegyetem Biológia, Kémia, Gyógyszerészet Tanszékén, benyújtotta: Dipl.-Chem. Meike Roskamp, Papenburg, 2010. január
2 1. bíráló: Prof. Dr. Sabine Schlecht 2. bíráló: Prof. Dr. Hans-Ulrich Reissig vitája
4 Dr. Szeretnék köszönetet mondani Jens Dernedde-nek a kellemes együttműködésért a szelektint kötő nanorészecskék és a nanorészecskék toxicitásának vizsgálatában. Ezúton szeretnék köszönetet mondani Papp Ilonának a jó együttműködésért és a segíteni akarásért. Ezúton is szeretnék köszönetet mondani a Kémiai és Biokémiai Intézet minden szolgáltató részlegének, különös tekintettel dr. Johann Spandl az IR spektrométerrel való ismerkedésért és Rita Friese a TGA elvégzéséért. Szeretnék köszönetet mondani Michael Stasiaknak a munka lektorálásáért és az írás során nyújtott erkölcsi támogatásáért. Szeretnék köszönetet mondani Nelly Rivas, Franziska Buchner, Kathera Hazin, Mareike Noah és Christina Lüders diákoknak a szintetikus támogatásért. Szeretnék köszönetet mondani legjobb barátnőmnek, Annette Brunsennek a nagy távolság és a szervezeti képességeimre gyakorolt pozitív hatás ellenére mindig nyújtott támogatásért. Köszönöm szüleim támogatását, amelyre mindig támaszkodhattam. Köszönöm Fritz Wilhelm Wernicke-nek a visszafolyó hűtő szépítését, az asztalom kis jegyzeteit és a városnézéseket, a támogatását és a türelmét.
5 Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék 1 Motiváció 7 2 Bevezetés a munkaterületbe Nanorészecskék szintézise és jellemzése Nanorészecskék szintézise Nanorészecskék jellemzése Nanorészecskék felületi funkcionalizálása Ligandcsere-reakciók Reakciók a ligandum perifériáján Molekulák adszorpciója a ligandumhéjon A felület-funkcionalizálás számos módszerének kombinációja Többdimenziós nanorészecskék Toxicitás A lefedett orvosi terület áttekintése 40 3 Eredmények és megbeszélés A nanorészecskék szintézise Au kolloidok szintézise és jellemzése Ag kolloidok szintézise és jellemzése Au/Ag-Alloy kolloidok szintézise és jellemzése CdS kolloidok szintézise és jellemzése Peptid által kiváltott A nanorészecskék összesítése Az alkalmazott peptidek szerkezete és tulajdonságai Töltött nanorészecskék az elektrosztatikus elrendezés építőkövei A nanorészecskék kezelése és stabilitása a puffer VW05-indukálta negatív töltésű NP-kben Nanorészecskék által indukált fibrillaképződés Szelektint kötő nanorészecskék 109 5
6 Tartalom-jegyzék A gátlás függése a szulfatáció mértékétől Az IC 50 értékek reprodukálhatósága A megkötő ligandum szerkezetének hatása A peptidkötés hatása A lánc hosszának hatása A nanorészecske méretének hatása A vizsgált tényezők hatásának összehasonlítása az IC 50 értékre TEM vizsgálatok Az NP sejtmérgezése Az NP immobilizálása in Polimer szálak Összefoglalás és kilátások Összegzés Kísérleti rész Rövidítések Oldószerek és reagensek Szintézisek NP-szintézisek Ligandcsere-reakciók A ligandumok NP-szintézisének kovalens módosítása Alkalmazott készülékek és mérési módszerek Dialízis gél elektroforézis NMR spektrométer IR spektrométer Termogravimetriás elemzés (TGA) Transmissziós elektronmikroszkóp (TEM) UV/Vis- Spektrométer kompetitív SPR-alapú kötési vizsgálat Bibliográfia 216. függelék 6
23 2 Bevezetés a munkaterületbe 2.7. Ábra: Lipáz-koordinált Au nanorészecskék előállítása kattintási kémia alkalmazásával [77]. Az azid és az alkin közötti arany-NP-k felületén az 1,3-dipoláris ciklusterápiának kinetikáját Thode és Williams tanulmányozta (a sémát lásd a 2.8. Ábrán) [79]. Az oldószer mellett az alkin-keton szubsztituensei, a linker lánchossza, azaz. H. a molekula összekötő része, az azidcsoport és az NP felület között, valamint az azidcsoportok sűrűsége a részecske felületén. Az oldatban és a részecske felületén lejátszódó reakció átfogó összehasonlítását nem végezték el, de a konverziós arányok nagyon hasonlónak látszanak [80]. Érdekes módon a funkcionális csoportok részecske felületén elfoglalt sűrűségének változása nagyobb hatással volt a kapott hozamra, mint bármely más, ebben a vizsgálatban vizsgált paraméter. 2.8. Ábra: A triazol képződésének általános sémája arany NP-ken [79]. 23.
45 2 Bevezetés a glikokonjugált arany nanorészecskék [153, 157] és a kadmium-szulfid nanorészecskék [158] területére és megvizsgálták azok tapadásgátló tulajdonságait, illetve félvezető nanorészecskék esetében a sejtek jelölésére való alkalmasságukat. Ennek a munkacsoportnak a célja a szénhidrát-szénhidrát kölcsönhatások jobb megértése [159], de a szénhidrát-közvetített sejt-sejt adhéziós folyamatok, például a gyulladásos folyamat hatása is. A polimer részecskék hordozóként is szolgálhatnak a mono- és ligos szacharidok számára. Haag és mtsai. 2008-ban kimutatta, hogy a galaktóz-funkcionalizált poliglicerin-részecskék képesek gátolni a szelektin kötődését [160]. A részecskék funkcionalizálódásának mértékétől való függésen túl ebben a munkában egyértelműen javult a kötési tulajdonságok javulása a galaktózmaradékok szulfatálása után. Ez a megfigyelés egybeesik Linhardt et al. a heparinra vonatkozó megfigyelések (lásd fent). 45
67 []/(10 3 degcm 2 dmol -1 maradék -1) 3 Eredmények és megbeszélés VW19 RR/nm 3.25. Ábra: 50 µm VW19 és 50 µm RR01 CD-spektrumai pH 7,4 mellett. A VW19 és RR01 szerkezetének részletesebb leírása a koncentráció és a ph érték függvényében Pagel és munkatársai publikációiban található. [182, 183] -ból vehető át. A 3.5. Táblázat a peptidek számított nettó töltését mutatja a ph érték függvényében. A VW19 pozitív töltésű pH 10 alatt és negatívan töltődik felette. Az RR01 már negatívan töltődik kb. Ph 5-től. Míg a VW19 ezért pozitív nettó töltéssel rendelkezik semleges oldatokban, és így vonzó elektrosztatikus kölcsönhatásba lép negatív töltésű NP-kkel, az RR01 negatív nettó töltéssel rendelkezik ebben a pH-tartományban, ami taszító elektrosztatikus kölcsönhatásokra utal negatív töltésű NP-kkel. Az ellenkezője igaz a pozitív töltésű NP-kre. Az RR01 alkalmazásával vonzó elektrosztatikus kölcsönhatások lépnek fel ebben a ph értéktartományban, míg a VW19-vel repulzív elektrosztatikus kölcsönhatásokra kell számítani. 3.5. Táblázat: A VW19 és RR01 peptidek nettó töltése különböző pH-értékeken [179]. ph értékek nettó töltés VW19 [e/peptid] nettó töltés RR01 [e/peptid]
88 3 Eredmények és megbeszélés 3.43. Ábra: TEM képek a MUDS koordinátájáról. Au-NP (d = 6 nm) pH-n 9, 10 mm-es Tris/HCl pufferben (a) és (b, c és d) 10 µm VW05-tel. Míg a peptid nélküli NP-ket elkülönítették és viszonylag egyenletesen oszlottak el a TEM rácson, a részecskék tiszta aggregációja látható volt 10 µm VW05 jelenlétében. A több, 100 nm nagyságú NP-peptid aggregátumok mellett néhány egyedileg fekvő NP is megtalálható ezen a peptidkoncentráción és előállításon. Az előzetes tesztek TEM képeihez (3.40. Ábra) képest úgy tűnik, hogy az aggregátumok szerkezete helyenként bizonyos rövid hatótávolságú sorrenddel rendelkezik (lásd a 3.43. Ábra d), de a részecskék jelentősen javuló diszperzitása ellenére nincs hosszú távú sorrend. A minta kiszáradása a rács előkészítése során olyan aggregációs hatásokhoz vezethet, amelyek az oldatban nem fordulnak elő. Az így elkészített minták ezért csak korlátozott következtetéseket engednek levonni a 88 helyzetről a komponensek összesítésének állapotára vonatkozóan
89 3 Eredmények és vita a megoldásban. Az oldószer eltávolítása rendezett struktúrák összeomlásához is vezethet, ha az NP-DNS aggregátumokból ismert [104], a szerkezet nagy százalékát az oldószermolekulák foglalják el. Így az oldatban lévő NP-peptid aggregátumok sorrendjének nem feltétlenül kell megegyeznie az ilyen előkészített TEM képeken látható sorrenddel. A Cryo-TEM felvételek előnye, hogy a mintát nem szárítják, hanem fagyasztják, így a minta a megoldás során összehasonlítható állapotban van a mérés során jelenlévő komponensek közötti távolság tekintetében. A MUDS-koordináció krio-TEM képei. Az Au-NP és a VW05 pH-érték 9-nél a 3.44. Ábrán látható, és lényegében ugyanazokat az eredményeket szolgáltatja az NP-k aggregálódási viselkedése és az aggregátumok sorrendjének mértéke tekintetében, mint a 3.43. Ábra. 3.44. Ábra: Cryo-TEM képek 0,05 µm-es MUDS-koordinátáról. Au-NP (d = 6 nm) ph 9-nél és különböző nagyítások (a és b) VW05 nélkül és (c és d) 10 µm VW05-tel. 89
Ezért az eredmények és a megbeszélések elvégzéséhez oldószer cserére lenne szükség. Erre a munkára már nem volt lehetőség. 3.46. Ábra: 0,05 µm-es MUDS-koordináció 80 ° C-on temperált keverékének TEM-képei. Au-NP és 10 µm VW05. Egy másik érdekes megfigyelés történt, amikor a csapadékot ultrahanggal kezelték. A korábban lila, zavaros oldat ultrahanggal végzett kezelés révén ismét tiszta és vörös lett. Az aggregátumok szuszpenziójának fotói az ultrahangos kezelés előtt és után a 3.47. Ábrán láthatók. Rövid idő elteltével (kb. 10 perc) a csapadék és a lila szín visszahúzódott. Még nem tisztázott, hogy ez a folyamat kizárólag az aggregátumok mechanikai aprításának vagy ultrahang által kiváltott változásnak köszönhető-e a peptid konformációjában. 3.47. Ábra: Fotók 0,05 µm MUDS-koordináció keverékéről. Au-NP 10 µm VW05-gyel (a) kb. 20 másodperces ultrahangkezelés előtt és (b) után. 92
94 3 Eredmények és megbeszélés h, 6 h, 20 h max/nm c (sr05)/M 3.49. Ábra: 0,05 µm MUDS-koordináció abszorpciós maximuma. Az Au-NP az SR05 koncentrációtól függően, pH 9-nél (10 mm Tris/HCl puffer) közvetlenül az összetevők összekeverése után, 6 és 20 óra elteltével. A pozitív töltésű SR05 peptid és a negatív töltésű NP-k között vonzó elektrosztatikus kölcsönhatások voltak, ami az abszorpciós spektrumok enyhe növekedését eredményezte (lásd a 3.49. Ábrát és a függelék 8.1.5. Szakaszának spektrumait), és a gélelektroforézis enyhe növekedését eredményezte. Az NP-sávok lassulása növekvő peptidkoncentráció mellett (lásd 3.50. Ábra). A VW05-tel végzett vizsgálatokkal ellentétben azonban nem volt megfigyelhető csapadékképződés és az abszorpciós maximumban nem történt jelentős eltolódás. 3.50. Ábra: Gélelektroforézis MUDS-koordinált Au-NP-k és SR05 keverékein, pH 9-nél, bal felső sarokban: fehér fénynek kitett agarózgél, balra lent: 254 nm UV-fénynek kitett agarózgél, jobbra: táblázat az alkalmazott minták keverési arányával. A zsebek helyzetét piros vonallal jelöltük. 94. o
129 3 Eredmények és megbeszélés Az NP11-et az NP10-re immobilizált amin enantiomerjével funkcionalizáltuk, majd szulfatáltuk. E két kolloid IC50-értékei (lásd a 3.10. Táblázatot) mind az L, mind a P szelektin esetében nem különböznek szignifikánsan egymástól. Az enantiomerek tehát ebben a példában azonos kötési tulajdonságokkal rendelkeznek. A 3.11. Táblázat két további aminopirán-funkcionalizált kolloid IC50-értékét mutatja. Az NP12 és NP13 különbözik egy szulfátcsoport jelenlétében (a 3.11. Táblázatban kék színnel jelölve). Míg az NP12 ligandumonként három szulfátcsoportot mutat, addig az NP13 ligandumának csak kettő van egyébként azonos szerkezetű. 3.11. Táblázat: A szulfatált Au-NP IC 50 értékei. Az Au NP-k magátmérője kb. 6 nm, a zöld színnel jelölt értékeket egy másik NP-köteggel határoztuk meg, de matematikailag ehhez a táblázathoz igazítottuk őket. Inhibitor neve IC 50 L-szelektin IC 50 P-szelektin IC 50 E-szelektin S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 1660 pm N.I. S3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 300 pm N.I. S 3 Na S3Na Au S 9 N H S3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. 129
132 3 Eredmények és tárgyalási táblázat: 3.13: A hidrofób komponenseket hordozó ligandumokkal rendelkező szulfatált Au NP-k IC50-értékei. Az Au-NP magátmérője körülbelül 6 nm. Inhibitor jelölés IC 50 L - szelektin IC 50 P - szelektin IC 50 E - szelektin S 3Na S 3Na Au S 9 N H NP pm 130 pm N.I. S 3 Na NP pm 150 pm N.I. Au S 9 N H S 3Na S3Na Au S 9 N H S 3Na NP7 80 pm 130 pm N.I. Érdekes módon a MUDS-koordinált Au kolloidok (NP18) szintén képesek gátolni az L- és P-szelektin kötődését. A MUDS-koordinált Au-NP-k hátránya, hogy gyengébb aggregációs stabilitásuk pH-értéknél 9-nél kisebb. Az itt bemutatott kísérletekhez 30 nmoláris oldatot készítettünk (az NP-koncentráció alapján) és 24 órán belül megvizsgáltuk. A MUDS-koordinátára vonatkozó IC 50-értékek. A kb. 6 nm magátmérőjű Au NP-ket a 3.14. Táblázat tartalmazza. Összehasonlításképpen itt meghatároztuk az NP7 és a MUD-szulfáttal koordinált Au NP-k (NP19) IC50 értékeit is, amelyek magátmérője körülbelül 6 nm. Az NP18 és NP19 szintéziseit már bemutattuk a szakaszban (a ligandumcsere sémája lásd a 3.29. Ábrát). 132
134 3 Eredmények és megbeszélések NP-k a citrát-koordinált Au NP-kkel, amelyek a felületükön karboxilát-funkciókat is bemutatnak. Míg a MUDS koordinálja. Az Au-NP az L- és P-szelektin IC50-értékekhez a pikomoláris tartományban nem tudta gátolni a szelektin kötődését a citrátkoord jelenlétében. Az Au NP-k megfigyelhetők. A negatív töltésű alépítmény mellett ezért további követelményeknek kell megfelelni a jó kötési affinitás elérése érdekében. Nem elég negatív töltésű részecskét ajánlani egy bizonyos mérettartományban a megkötéshez. A citrát-koordinátor kötési viselkedése. Az Au-NP már jelzi, hogy a mért eredmények nem a szelektin és a nanorészecskék közötti nem specifikus kölcsönhatások miatt következnek be. A 3.71. Ábra további két példát mutat be az NP-kről, amelyek nem mutattak semmilyen gátló hatást a kompetitív kötési vizsgálatban. a) b) Au N N Au S H 3.71. ábra: a) DMAP koordináta. Au-NP és b) Pol1-koordinátum. Au NP 9.
Még a magas NP-koncentrációk mellett is, a nem kötő Au NP-k L-szelektinnel történő inkubálása után 100% -os relatív kötődést értünk el, és így nem gátoltunk. Ennek eredményeként nincsenek mérhető nem-specifikus kölcsönhatások a szelektin és az NP-k között. Összefoglalva: az itt vizsgált összes poliszulfatált NP-re a pikomólos tartomány IC50 értékeit kaptuk, a szerkezettől függetlenül. A ligandum szerkezete és különösen a szelektinhez való kötéshez rendelkezésre álló csoportok térbeli elrendezése erős hatást gyakorolt az NP-k kötődési tulajdonságaira. Bonyolultabb struktúrák esetén az L- és P-szelektinhez való szelektív kötődési viselkedés is elérhető. A P szelektivitás különösen olyan ligandumoknál fordult elő, amelyek könnyen alakíthatók és szterikusan kevésbé igényesek voltak. Az egyszerű struktúrák mindkét szelektint gátolták, hasonló IC50 értékekkel. 9 A Pol1 polimert Marie Weinhardt szintetizálta. 134