A nukleoszómák mint sejthalál paraméterek malignus daganatos betegeknél - PDF ingyenes letöltés
A Ludwig-Maximilians-Universität München Igazgatóság Klinikai Kémiai Intézetéből: Prof. Dr. Dr. h.c. D. Seidel-nukleoszómák, mint sejthalálparaméterek rosszindulatú daganatos betegeknél Értekezés az orvosi doktori fokozat megszerzéséről a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem Orvostudományi Karán, Stefan Holdenrieder, Jettingen-Scheppach 24
II A Müncheni Egyetem Orvostudományi Karának jóváhagyásával 1. Riporter: Prof. Dr. Dr. h.c. D. Seidel 2. előadó: Prof. Dr. C. Nerl társelőadó: Priv. Doz. R. Holle Prof. Dr. J. P. Johnson a PhD munkatársának társfelügyelete: Dr. Petra Stieber Dean: Prof. Dr. Dr. h.c. K. Peter szóbeli vizsga napja: 15.1.24
III Szüleimnek szenteltem
IV Korábbi publikációk: Szabadalmi bejelentés: Roche Diagnostics, Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Schalhorn A A terápia nyomon követése olyan betegeknél, akiknél betegség vagy terápia következtében apoptózis indukálódik, apoptotikus detektálással Termékek. Szabadalmi szám: 4918/OA/WO - Ts Eredeti cikkek: Holdenrieder S, Stieber P, Förg T, Kühl M, Schulz L, Busch M, Schalhorn A, Seidel D Apoptózis szilárd daganatos betegek szérumában Anticancer Res. 19: 2721-2724 (1999) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Ready G, Fürst H, Schmeller N, Untch M, Seidel D szérum nukleoszómák a sejthalál markereként Clin Chem Lab Med 39: 596-65 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Nucleosomes benignus és malignus betegségben szenvedő betegek szérumában Int J Cancer (Pred Oncol) 95: 114-12 (21 ) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, v Pawel J, Schalhorn A, Nagel D, Seidel D Keringő nukleoszómák a szérumban Ann NY Acad Sci 945: 93-12 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D A szérum nukleoszómáinak mennyiségi meghatározása Cell Death Detection ELISA plusz Biochemica 1 (22): 25-27
VI TARTALOM 1 BEVEZETÉS ÉS KÉRDÉSEK I 2 HÁTTÉR 4 2.1 SEJT HALÁL 4 4 2.1.1 A SEJT HALÁL KUTATÁSÁNAK TÖRTÉNETE 4 2.1.2 DIKOTOMIKUS SEJT HALÁLMODEL 1 2.1.3 INTEGRÁLT SEJT HALÁLMODEL 17 2.1.4 A sejtek halála a fiziológiai folyamatokban 21 2.1.5 6 APOPTOTIKUS HALÁL GENETIKUS SZABÁLYOZÁSA 28 2.1.7 APOPTOTIC SEJT HALÁL SZIGNÁLIS ÚTJAI 31 2.1.8 APOPTOTIC SEJT HALÁL INDUKTORAI 4 2.1.9 A SEJT HALÁL ÉSZLELÉSÉNEK MÓDSZERE 43 2.2 NUKLEOSZOMÁK 57 2.2 2.2.1 A Z SZERKEZETE ÉS FUNKCIÓJA A nukleinsavak keringése a plazmában és a szérumban 68 3 A NUKLEOSOMENTOS VIZSGÁLAT MÓDSZERTANI HÁTTERE 8 3.1. IMMUNKÉMIAI ÉSZLELÉSI ÉS MÉRÉSI MÓDSZEREK 8 3.2 A KEZDŐ VIZSGÁLAT MÓDSZERI ALAPJA 82 3.3 A MÓDOSÍTÁSAI ÉS A STANDARDIZÁLÁS 9 BETEGEK 92 4.1.1 EGÉSZSÉGES SZEMÉLYEK 92 4.1.2 BETEGEK Jótékony betegségekkel 92 4.1.3 MALIGNAI BETEGSÉGŰ BETEGEK 94 4.2 STATISZTIKAI MÓDSZEREK 97 4.2.1 A KLINIKAI-DIAGNOSZTIKAI MINŐSÉG ÉRTÉKELÉSE 97 4.2.2 STATISZTIKAI ELJÁRÁSOK ÁTALAK ÁGAZATOS VIZSGÁLATOKBAN 12 4.2.3 STATISZTIKAI ELJÁRÁSOK 13
3 1. Különböznek-e a spontán nukleoszómakoncentrációk egészséges emberekben, jóindulatú betegségekben és rosszindulatú daganatokban? Lehetséges diagnosztizálni a rosszindulatú betegségeket? 2. Különböznek-e a spontán nukleoszóma koncentrációk a különböző daganat típusokban? 3. Különböznek-e a spontán nukleoszómakoncentrációk a tumor jellemzői, például a stádium, az osztályozás vagy a szövettan szempontjából? 4. Milyen változások következnek be a nukleoszóma koncentrációjában a műtétekből, a fertőzésekből és az egymást követő antibiózisból, valamint a kemoterápia és a radioterápiás kezelés során? 5. Malignus betegségben szenvedő embereknél a kemoterápia és a sugárterápia által kiváltott nukleoszóma-koncentráció változásai összefüggenek-e a terápiára adott klinikai válasszal és a képalkotási eredményekkel? Végezhető-e terápiás monitorozás nukleoszómák alkalmazásával? Mennyire biztonságosan és milyen korán lehet felmérni a terápia hatékonyságát? 6. A kemoterápia és a radioterápia során a nukleoszóma koncentráció korrelál-e más onkológiai biomarkerekkel, amelyeket a terápia hatékonyságának szabályozására használnak? Lehetséges-e a terápiás siker összehasonlítható vagy megbízhatóbb értékelése nukleoszómák alkalmazásával?
6 Az 1960-as évek elején R Lockshin és C Williams a rovarmodellt alkalmazták a sejthalál során bekövetkezett folyamatok tanulmányozására, és a programozott sejthalál kifejezést területi és időbeli kiszámítható folyamatként fogalmazták meg (Lockshin 1964). Valamivel később Tata és ismét Lockshin kimutatták, hogy a makromolekulák szintézise szükséges ehhez a sejthalálhoz. RNS és fehérje inhibitorokkal hatékonyan tudták megakadályozni (Tata 1966; Lockshin 1969). Végül, 1971-ben, John F. Kerr leírta az úgynevezett zsugorodási nekrózist, egy olyan változássorozatot, amelyet a patkányok portális vénájának elzáródása után a máj egyedi, haldokló sejtjeiben figyelt meg, amelyek később atrófiává váltak (Kerr 1971). John F. Kerr Andrew Wyllie Sir Alastair Currie Egy évvel később Andrew Wyllie-vel és Sir Alastair Currie-vel együtt bevezette az apoptózis kifejezést, a görög nyelvből átvett kifejezést, amely az őszi levelek esését jelöli, és a modernitás új korszakát hirdette meg. Sejthalál-kutatás (Kerr 1972). 2-4. Ábra (Cummings 1997): Első személy, aki leírta az apoptózist 5. és 6. ábra (Kerr 1994): Tipikus morfológiai jellemzőkkel rendelkező apoptotikus sejtek
9 8. ábra: A sejthalál kutatásának kronológiája
1 2.1.2 Dichotomikus sejthalál modell Történelmi okokból, miután Kerr bevezette az apoptózis kifejezést, kezdetben különbséget tettek a sejthalál típusai között, amelyek külső és belső ingerekből származnak. A sejtek öngyilkosságát legalább három típusra osztották: iszkémiás sejtpusztulásra, szabadgyökös sejtpusztulásra és genetikailag szabályozott apoptózisra (Majno 1995). Gräper javaslata szerint utóbbi képezte a mitózis megfelelőjét. A nekrózist kezdetben makroszkóposan az elhalt szövet maradványainak tekintették. Sejtszinten a nekrózist a külső ingerek által kiváltott passzív sejthalálnak írták le, ellentétben a belső, aktívan végrehajtott sejtdegradációval, azaz apoptózissal. Ezt a két formát dichotóm módon alkalmaztuk az összes sejthalál-jelenségre; a sejthalál egyéb formáit nagyrészt figyelmen kívül hagyták (Wyllie 198a; Kerr 1994). 9. ábra: Klasszikus sejthalál-modell (Majno 1995-től módosítva): a sejtmag kromatintörésének kondenzációja ép plazma membrán apoptózis dehidráció és a sejt apoptotikus testének zsugorodása a sejt duzzanata és a mitokondriumok repedése a plazma membrán nekrózisban
21 2.1.5 Sejtpusztulás a kóros folyamatokban A sejthalál és a sejtproliferáció a szervezetben, valamint az egyes szervekben és funkcionális rendszerekben finoman szabályozott egyensúlyban van. Ha ez az egyensúly megszakad, a betegségek minden szinten kialakulhatnak: Homeosztázis Sejtpusztulás proliferáció A proliferációs arány túlsúlya a sejtpusztulási arány felett helyi és szisztémás rosszindulatú betegségekhez, valamint anyagcsere-, gyulladásos és néhány autoimmun betegséghez vezethet. Hiperproliferatív betegségek Sejtpusztulás proliferáció A túlzott sejthalál viszont számos degeneratív, hematológiai, autoimmun, ischaemiával kapcsolatos, toxin által közvetített és gyulladásos betegség kialakulásának alapja. Degeneratív és destruktív betegségek Proliferáció Sejtpusztulás Az alábbi táblázat összefoglalja a sejthalál jelentőségét a különféle betegségekben (Thompson 1995; Fadeel 1999; Robertson 22):
36 A jelutak szabályozása A receptor által közvetített apoptózis megindításához és megvalósításához az összes sejt számára közös központi jelátviteli utat azonosítottak, és a sejttípustól és a kiváltó ágenstől függően néhány változó szakaszt ismertettek. A gyakori tényezők közé tartozik a DISC képződése trimerizált receptorokból, az FADD és az iniciátor prokaszpáz 8, valamint az effektor kaszpázok végső szegmense, különösen a kaszpáz 3, amely a sejtstruktúra és a magot hasító proteázok aktiválásához vezet. Közöttük három változó szakasz található: 1. a kaszpáz kaszkád közvetlen aktiválása 2. a mitokondriumok részvétele a citokróm C felszabadulásával 3. a mitokondriumok aktiválása és az AIF felszabadulása annak az útnak megfelelően, amelyen haladhat az apoptózis elvégzéséhez két sejttípus különböztethető meg (Scaffidi 1998; Krammer 2a, b): CD95-L CD95-R 18. ábra: Apoptotikus jelátviteli utak az I és II típusú sejtekben (módosítva a Krammer 2a-ból) FADD/MORT1 DD DD DD DD DD DD FADD Pro - CASP-8 DISC c-flip BID Bcl-2 Bcl-x L CASP-8 Cyto c - Apaf-1 CASP-3 CASP-9 CASP-8 AIF Halál szubsztrátok I. TÍPUS Apoptózis II. TÍPUS
Az effektor kaszpázok számos inhibitora IAP-ként (apoptózis inhibitorok) csoportosul. Az emberi sejtekben ezek közé tartozik a XIAP (MIHA), a c-iap-1 (MIHB), a c-iap-2 (MIHC), a NAIP és a survivin. Az aktivált 3-as és 7-es kaszpázoknál és az apoptómánál kezdődnek, és gátló hatásukban jelentősen eltérnek egymástól. (Cecconi 1999; Budjhardjo 1999, Thornberry 1998; Jäättelä 1999; Deveraux 1999; Goyal 21). Fontosságuk valószínűleg az apoptózis szignáljának finom szabályozásában rejlik. Ezt támasztja alá további IAP-szabályozó fehérjék, például a Smac (a kaszpázok második mitokondrium-eredetű aktivátora) és a DIABLO (közvetlen IAP-kötő fehérje, alacsony pi-értékkel) (Hengartner 2) felszabadulása apoptózis során. Az apoptózis szignálpályák legfontosabb összetevőit, beleértve a gátló kiindulási pontokat, az alábbiakban mutatjuk be: FADD/MORT1 DD DD DD DD DD CD95-L CD95-R FADD/MORT1 DNS károsodás p53 19. ábra: A jelutak szabályozásának áttekintése apoptózisban (módosítva) Hengartner 2 és Rosell 22 szerint) Pro- CASP-8 DISC BID Bcl-x L Bax Bcl-2 c-flip Bcl-2 Bcl-x L CrmA CASP-8 citokróm c Pro-CASP-9 Bcl-x L Pro-CASP -3 APAF-1 apoptózis CASP-3 IAP Smac/DIABLO AIF halál szubsztrát apoptózis
62 A DNS szuperhélix spirális csavarodása a nukleoszómán belül, amely a hiszton-DNS érintkezések lazulása után megcsavarja és elmozdítja a hiszton komplexet (Widom 1997; Kornberg 1999). Ezen komplexek némelyikének, például a NURF nukleoszóma-átalakító faktor működéséhez az acetilezett hisztonvégek bevonása szükséges. A kromatin átalakító komplexek áttekintését a következő táblázat tartalmazza (Kornberg 1999): Promoter P mrna k 12 P nukleoszóma k 21 P DNS csavarodása és a transzkripció P progressziójának DNS progressziójának expozíciója 26. ábra: ISWI komplexek kromatin átalakítása (Widom 1997) 8. táblázat: A kromatatin átalakító komplexek csoportosítása és jellemzői Kromatin átalakító komplexek Szervezet ATPáz Molekulatömeg (MDa) SWI/SNF család SWI/SNF S. cerevisiae SWI2/SNF2 2 11 RSC S. cerevisiae STH1 1 15 Brahma D. alegységek melanogaster Brahma 2 ND H SWI/SNF H.sapiens hbrm 2 1 H SWI/SNF H.sapiens BRG1 2 1 NRD H.sapiens CHD4 1,5 18 ISWI család I SWI1 S.cerevisiae ISWI1,4 4 I SWI2 S.cerevisiae ISWI2,3 2 NURF D.melanogaster ISWI, 5 4 CHRAC D.melanogaster ISWI, 7 5 ACF D.melanogaster ISWI, 2 4 RSF H.sapiens hiswi, 5 2