A Tbc1d1 törlés elnyomja az elhízást a leptinhiányos egerekben - International Journal
alanyok
absztrakt
Háttér:
A TBC1D1 gén változatai több faj elhízással kapcsolatos tulajdonságaiban szerepet játszanak, beleértve az embereket, egereket, nyulakat és csirkéket. Míg a TBC1D1 variánsai összefüggenek az emberek elhízásával, a Tbc1d1 gén megbomlása csökkentette az egerek testtömegét. A TBC1D1-t az inzulinfüggő glükóz transzport szabályozójaként azonosították a vázizomzatban, de elhízott betegeknél az energia homeosztázisban betöltött szerepe továbbra sem tisztázott. A TBC1D1 hiány hatását az energia homeosztázisra, a glükóz és a lipid anyagcserére vizsgálták az elhízás megállapított egér modelljében.
Mód:
Elhízott leptin (ob/ob) és Tbc1d1 kettős hiányban szenvedő egerek (D1KO-ob/ob) keletkeztek a túlsúlyos B6 keresztezésével. V. Lep ob/ob egerek sovány Tbc1d1 hiányos egerekkel C57BL/6J háttérrel. A standard étrendben (SD) vagy a magas zsírtartalmú étrendben (HFD) részesülő hím egereket testtömeg, testösszetétel, táplálékfelvétel, önkéntes fizikai aktivitás és energiafelhasználás szempontjából közvetett kalorimetriával értékelték. Elemezték a glükóz- és inzulin toleranciát, valamint a glükóz transzportot és a vázizomzat zsírsav oxidációját.
Eredmények:
Elhízott egereknél a Tbc1d1 hiány az SD és a HFD súlycsökkenéséhez vezetett. A táplálékfelvétel azonban változatlan maradt SD-n, vagy akár növekedett is a HFD-vel táplált Tbc1d1-hiányos egerekben az önkéntes fizikai aktivitás változása nélkül. A szignifikánsan csökkent inzulin-stimulált glükóztranszport és a megnövekedett zsírsav-oxidáció ellenére az intakt izolált vázizomzatban az elhízott Tbc1d1-hiányos egerek nem mutattak szignifikáns változásokat a glikémiában és a glükóz toleranciában az elhízott kontrollokhoz képest. A közvetett kalorimetria azt mutatta, hogy az elhízott Tbc1d1-hiányos egereknek csökkent a légzési hányadosa, és megnövekedett a napi energiafelhasználás.
Következtetések:
Elhízott leptinhiányos egereknél a TBC1D1 hiánynak nincs hatása az etetési viselkedésre vagy az energiafogyasztásra, de megnövekedett energiafelhasználáshoz, megváltozott energiaszubsztrát-preferenciához, fokozott zsírsav-oxidációhoz és elhízáscsökkentéshez vezet. A TBC1D1 evolúciós szempontból konzervált szerepet játszhat a gerincesek energiaháztartásának szabályozásában.
bevezetés
Anyagok és metódusok
anyagok
A humán rekombináns inzulint (Actrapid HM Penfill) a Novo Nordisk Pharma GmbH-tól (Mainz, Németország), az AICAR-t (Aminoimidazole Carboxamide Ribonukleotide) az Enzo Life Sciences, Loerrach, Németország vásárolta. A radiokémiai anyagokat a Hartmann Analytic cégtől (Braunschweig, Németország) szereztük be ([1–14 C] -D-mannit, 0,1 mCi ml -1) és az American Radiolabeled Chemicals-tól (St. Louis, MO, USA) [[9, 10 (n) - 3 H] palmitinsav, 1 mCi ml -1; 2- [1, 2- 3 H (N)] dezoxi-D-glükóz, 1 mCi ml -1.
Elhízott Tbc1d1-hiányos állatok generálása
Genotipizálás
Az egér farokcsúcsaiból származó genomi DNS-t az InViSorb Genomic DNA Kit II (Invitek, Berlin, Németország) alkalmazásával izoláltuk. Az egerek genotípusát Tbc1d1-re (D1KO-Fwd: 5'-CAA-CAT-TCT-GAA-GGC-CTT-CTG-3 ', D1KO-Rev: 5'-TCC-CTG-ACA-AGC-TGA-GT- 3 '; WT-Fwd: 5'-GGA CAA GCA GCTT TCT TGT TT-3', WT-Rev: 5'-TCC TGG TCC AGA AGC GAG-3 ') és az ob- párhuzamosaknak (Fwd: 5'- TGT CCA AGA TGG ACC AGA CTC-3 '), Rev: 5'-ACT-GGT-CTG-AGG-CAG-GGA-GCA-3').
RNS extrakció és cDNS szintézis
Az RNS-t különféle egérszövetekből QIAzol és az RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) alkalmazásával extraháltuk a gyártó útmutatásai szerint. A cDNS-t 2 µg teljes RNS-ből írtuk át GoScript reverz transzkriptáz (Promega, Mannheim, Németország) és random P (dN) 6 hexamerek (Roche, Mannheim, Németország) alkalmazásával.
Valós idejű kvantitatív PCR
Valós idejű kvantitatív PCR-t TaqMan szondákkal (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) hajtottunk végre a Tbc1d1 (Mm00497989_m1), a PrlR (Mm00599957_m1) és az Actb (FAM-TTG AGA CCT TCA ACA CCC CAG CCA-TAMRA) szondákkal. . MWG, Ebersberg) mint háztartási gén. Az elemzéseket az Applied Biosystems (Applied Biosystems) Fast Real-Time PCR System 7500 készülékével végeztük. Az adatokat a ΔCt módszer szerint normalizáltuk, levonva a béta-aktin Ct értékét a célgén Ct értékéből. 16.
A testtömeg, a testösszetétel és a testhossz elemzése
A teljes testtömeget elektronikus mérleggel elemeztük (Sartorius, Göttingen, Németország). A testösszetételt (testzsír és sovány tömeg) magmágneses rezonancia spektrométerrel (Bruker-Minispec NMR analizátor mq10, Bruker Optics, Ettlingen, Németország) határoztuk meg. A test hosszát az orrtól a végbélnyílásig terjedő hosszúság mérésével elemeztük.
Glükóz, inzulin tolerancia tesztek
Egy éjszakán át tartó éhezés után az állatok szájon át kaptak orális glükóz bolust (2 g testtömeg-kilogrammonként, 20% -os oldat). Vérmintákat vettünk a farok hegyéből különböző időpontokban (0, 15, 30, 60 és 120 perc), és a glükóz- és inzulinszintet az alábbiakban leírtak szerint határoztuk meg. Az inzulin-tolerancia teszthez az egereket egy éjszakán át éheztettük, és 2 NE inzulint/testtömeg-kg-ot injektáltunk intraperitoneálisan. A vércukorszintet az injekció beadása után 0, 15, 30 és 60 perccel határoztuk meg.
Vérparaméterek
A vércukorszintet glükométerrel határoztuk meg (Contour, Bayer, Leverkusen, Németország). A plazma inzulint ELISA-val (Insulin Mouse Ultrasensitive ELISA, Alpco, Salem, MA, USA), plazma keton testeket mértük a Total Ketone Bodies autóskészlettel, szabad zsírokkal, savakkal a NEFA-HR 2 rendszerrel (mindkét Wako Chemicals, Neuss, Németország ). Az adiponektint az egér adiponektin ELISA kitjével (Millipore, Billerica, MA, USA), az IL-6, MCP-1, PAI-1 és a Resistin adipocitokineket Milliplex MAP Kit, Mouse Serum Adipokine (Millipore) és IGF elemzéssel elemeztük. -1 a DuoSet ELISA fejlesztőrendszerrel (R & D Systems, Abington, Egyesült Királyság). A triglicerideket és a szabad glicerint a szérum triglicerid meghatározó készlettel határoztuk meg (Sigma-Aldrich, Steinheim, Németország). Az összes plazma paramétert a gyártó által leírt módon határoztuk meg.
Elszigetelt vázizmok glükózfelvételének és zsírsav oxidációjának elemzése
Az egereket altattuk, és a hátsó lábak extenzor digitorum longusát és tallóizmait gondosan szétvágtuk. Az inkubációs táptalaj Krebs-Henseleit-hidrogén-karbonát-pufferből áll, kiegészítve 5 mM HEPES-szel és 0,1% zsírsavmentes szarvasmarha-szérum albuminnal. Az inkubálást vízfürdőben (30 ° C) folytattuk, folyamatos gázosítással (95% O 2/5% CO 2) és enyhe keverés mellett. A glükózfelvétel meghatározásához az extensor digitorum longus izmait 30 percig inkubáltuk 5 mM glükózzal és 15 mM mannittel, 120 nM inzulin hiányában vagy jelenlétében. 1 mM [3H] 2-dezoxi-glükózzal (2,5 mCi ml -1) és 19 mM [14 C] mannittel (0,7 mCi ml -1) 20 percig tartó utolsó inkubálás után az izmok azonnal folyékony nitrogént és jeget fagyasztva -80 ° C-on tárolva. A zsírsav-oxidáció sebességének meghatározásához a soleus izmokat Krebs-Henseleit bikarbonát-pufferben inkubáltuk, amely 5 mM glükózt, 15 mM mannitot, 3,5% zsírsavmentes szarvasmarha-szérumalbumint, 4 mCi ml -1 [ 3 H] palmitát és 600 μM jelöletlen palmitátot tartalmazott 2 mM AICAR-tal vagy anélkül 30 ° C-on 120 percig, és a radioaktivitást a táptalaj szcintillációs számlálásával mértük.
Közvetett kalorimetria
A légzési hányados és az EE elemzéseket másutt írták le. Röviden, az állatok a mérés előtt 24 órás adaptációs szakaszon mentek keresztül. A ketreceket klimatikus kamrába helyeztük 22 ° C-on, és az oxigénfogyasztást (VO 2) és a szén-dioxid termelést (VCO 2) 23 órán át követtük nyomon.
Takarmány-ital
A táplálékfelvételt és a fizikai aktivitást egy automatizált TSE elemző rendszerrel (302015-c/32 típus, TSE Systems, Bad Homburg, Németország) követtük nyomon. Az állatok szabadon hozzáférhettek a takarmányhoz, a takarmánykosarakban lévő víz- és súlyérzékelők rögzítették az egyes állatok által elfogyasztott takarmány mennyiségét. A fizikai aktivitást infravörös érzékelőkkel határoztuk meg.
Western blot elemzés
Máj trigliceridek
A májszövetet 10 mM nátrium-foszfát-pufferben, 1% poli (oxi-etilén-10-tridecil-etán) és 1 mM EDTA-val szöveti lizátor (Qiagen) alkalmazásával homogenizáltuk. A homogenizátumot 5 percig inkubáltuk 70 ° C-on, és 10 percig centrifugáltuk 16 000 rcf-n. A máj triglicerideket a felülúszóban mértük a (TRIGS) készlet (Randox, Crumlin, Egyesült Királyság) segítségével, a kézikönyvben leírtak szerint.
Szöveti glikogén
A szöveteket 1 M KOH-ban homogenizáltuk, 30 percig inkubáltuk 70 ° C-on, és tömény ecetsavval semlegesítettük. Amiloglükozidázt (Sigma-Aldrich) adunk hozzá, és a mintákat egy éjszakán át 37 ° C-on inkubáljuk. Centrifugálás után (10 perc, 2000 rcf) a felülúszóban lévő glükózt glükóz likőrrel (Human, Taunusstein, Németország) mértük a gyártó útmutatásai szerint.
Eredmények
A Tbc1d1 törlése elhízott egereknél a testtömeg jelentős csökkenéséhez vezet
A WT és D1KO ob/ob egerek testsúlya és testösszetétele. ( a ) Testsúly, ( ) Teljes testzsír-tömeg és ( c ) SD vagy HFD-n tenyésztett hím WT és D1KO-ob/ob egerek sovány testtömege. Az adatok átlagot jelentenek ± fél; n = 17-30 (SD) és n = 6-23 (HFD); * P −1 24 óránként ± 0,054 kJ g −1 naponta) 24 óra; D1KO-ob/ob: 1,44 kJ g −1 24 óránként ± 0,09 kJ g −1 24 órán keresztül). HFD etetésekor az elfogyasztott élelmiszer mennyisége szignifikánsan megnőtt a soványabb D1KO-ob/ob egerekben a WT-ob/ob állatokhoz képest (WT-ob/ob: 1,32 kJ g -1/24 h ± 0, 054 kJ) g-1/24 óra; D1KO-ob/ob: 1,63 kJ g −1 24 óránként ± 0,087 kJ g −1 24 órán keresztül; P = 0, 00015). Ezenkívül a fiatalabb, 7 hetes egerek táplálékbevitelének elemzése hasonló eredményeket mutatott, szignifikáns különbségek nélkül az SD-vel táplált állatokban, és a HFD-vel táplált Tbc1d1-hiányos D1KO-ob/ob egereknél nem volt szignifikáns a táplálékfelvétel (2d. Kiegészítő ábra). .
A WT és D1KO ob/ob egerek táplálékfelvétele és fizikai aktivitása. ( a ) A TBC1D1 szöveti eloszlása 16 hetes hím WT ob/ob egerekben, Western blot analízissel. ( ) A Tbc1d1 expressziója elhízott WT és D1KO-ob/ob egerek különböző agyi régióiban, valamint sovány WT-ob/+ egerekben, valamint WT és D1KO-ob/ob egerek vázizmaiban (M. quadriceps), amelyeket kvantitatív valós idejű PCR-t béta-aktinnal, mint háztartási génnel elemeztünk. A Tbc1d1 expresszióját normalizáltuk a WT egerek vázizomban való expressziójához. Az egerek 16 hetesek voltak, és SD-vel etették őket; Az adatok átlagot jelentenek ± fél; n = 6-10. ( c ) 24 órán át mért takarmánybevitel, a teljes testtömeghez és ( d Infravörös spektrummal elemzett önkéntes fizikai aktivitás SD vagy HFD-vel tenyésztett 15 hetes hím egerekben. Az adatok átlagot jelentenek ± fél; n = 5-11; * P -1 ± 0,032 kJ g -1; D1KO- ob/ob: 2,78 kJ g −1 ± 0,032 kJ g −1; P = 0,009) (3c - d ábrák).
A WT és D1KO-ob/ob egerek glikémiás kontrollja. ( a ) 17 hetes hím egerek vércukorszintje étkezés utáni állapotban SD-n vagy HFD-n. ( ) 12 hetes hím egerek vércukorszintjét etették SD-vel, és ( c ) megfelelő plazma inzulinszintek orális GTT alatt, 2 g glükóz/kg. ( d ) 14 hetes hím egerek vércukorszintje SD-ben tenyésztve, 2 NE/kg inzulinnal kilogrammonként, intraperitoneális inzulin tolerancia teszt során. Az adatok átlagot jelentenek ± fél; n = 5-9; * P3H] 2-dezoxi-glükóz a vázizomzatban a leírás szerint elemezve. Amint az 5a. Ábra mutatja, mindkét leptinhiányos csoport csökkent glükózfelvételt mutatott inzulinstimuláció alatt, összehasonlítva a sovány kontroll WT-ob/+ állatokkal (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg −1 20 perc alatt ± 0,40 nmol mg -1 naponta) 20 perc; WT-ob/+: 6,09 nmol mg −1 20 perc alatt ± 0,039 nmol mg −1 20 perc alatt; P = 0,079). A D1KO-ob/ob egerek azonban szignifikánsan csökkent inzulinnal stimulált glükózfelvételt mutattak a WT-ob/ob egerekhez képest (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg −1/20 perc ± 0,40 nmol mg −1 per 20 perc; D1KO-ob/ob: 3,26 nmol mg –1 20 percenként ± 0,19 nmol mg –1 20 perc alatt; P = 0,0019).
A megnövekedett zsírsav-oxidáció hatása a testtömeg alakulására azonban ellentmondásos. Az Acc2 -/- egerekkel végzett két független vizsgálatban felvetették, hogy a mitokondriumba történő nagyobb mennyiségű zsírsav beáramlás elegendő az EE növeléséhez és a testsúly csökkentéséhez. 21, 22 Ezen vizsgálatok egyikében az Acc2 -/- egereknél kimutatták, hogy a malonil-CoA szintje csökkent, ezért fokozott a β-oxidáció a vázizomzatban. 21 A második tanulmányban a szerzők az EE növekedését és a testtömeg csökkenését figyelték meg az Acc2 -/- egerekben, és arra a következtetésre jutottak, hogy ezek a hatások közvetlenül a megnövekedett zsírsav-ellátásnak és az azt követő oxidáció növekedésének tulajdoníthatók a mitokondriumokban . 22 Ezzel szemben Hoehn és munkatársai egy nemrégiben végzett Acc2 -/- egerekkel végzett tanulmányában 23 nem találtak változást az EE-ben vagy a testtömegben, ami arra utal, hogy a megnövekedett β-oxidáció nem biztos, hogy elegendő ahhoz, hogy megmagyarázza a Leptin és Tbc1d1 hiányos egerek.
Az elhízás korrelál a csökkent inzulinérzékenységgel, és fordítva, várható, hogy a testzsírtartalom csökkenése az inzulinérzékenység növekedéséhez vezet. 24 Bár a Tbc1d1-hiányos D1KO-ob/ob egerek, amelyek összes testzsírtartalma alacsonyabb volt, mint a kontrollok, szignifikánsan soványabbak voltak, a vércukorszint nem csökkent. Ezenkívül sem a glükóztolerancia, sem az inzulinérzékenység nem változott szignifikánsan ezekben az egerekben, ami azt jelzi, hogy a Tbc1d1-hiányos D1KO-ob/ob egerek vázizomzatában csökkent glükózfelszabadulás kompenzálta az elhízás elnyomásának jótékony hatását ezekben az egerekben tud.
A TBC1D1 mutációi emberi test testtömeg-szabályozásához is kapcsolódnak. Két tanulmány összefüggést mutatott a kódoló R125W variáns és a testtömeg index (BMI) között az elhízásra fogékony nőknél, míg a TBC1D1 egy nukleotid polimorfizmusa az EPIC Potsdam férfiakban és nőkben erős összefüggést talált a BMI és a derék kerületével kohorszá vált. 10., 11., 25. Sertések, nyulak és csirkék megfelelő állatkísérletei összefüggést tártak fel a TBC1D1 variánsok, valamint a testösszetétel és az elhízás között. 12, 13, 14, 15 Jelen vizsgálat elhízott egereken azt sugallja, hogy a TBC1D1 evolúciós szempontból konzervált szerepet játszik a gerincesek testtömegének és összetételének szabályozásában. Ennek a megfigyelésnek a molekuláris alapja és a TBC1D1 variánsok lehetséges evolúciós szelekciója további vizsgálatot igényel.