A zsírból származó szársejtek elkülönítése és megkülönböztetése a sertés szubkután zsírszövetétől

Bevezetés

Az elhízás, amely az Egyesült Államok lakosságának körülbelül 30% -át teszi ki, testtömeg-indexe meghaladja a 30-at, világméretű jelenségként jelent meg 1. Az 2–4-es elhízás általában a szív- és érrendszeri betegségekkel, a 2-es típusú cukorbetegséggel és a rákkal kapcsolatos szövődményekhez vezet. Ezért az elhízás kezelése fontos prioritás. Az elhízás a zsírszövet hatalmas kiterjedésében nyilvánul meg, és a modern társadalomban a túlevésnek és a mozgásszegény életmódnak tulajdonítható. Így az adipogenezis transzkripciós szabályozása és a lipogenezis megfejtése megígérheti az elhízás vagy a cukorbetegség kezelését.

A 3T3-L1, 3T3-F442A és más egér adipogén sejtvonalakat alkalmazták az adipogenezis vagy lipogenezis vizsgálatára a zsírszövet fejlődése során. Van azonban néhány eltérés a szabályozási mechanizmusokban az in vitro és az in vivo 6 állatsejtek között. A stroma vaszkuláris sejtfrakciójában található elsődleges zsírszövetből származó őssejtek (ADSC) közvetlenül izolálhatók a fehér zsírszövetből, és differenciálódásra indukálhatók. Az ADSC differenciálódása az adipocitákban nagy valószínűséggel összefoglalja az adipogenezis és a lipogenezis folyamatát a zsírszövet fejlődésében in vivo 7.

A sertések megfelelő állatmodell az adipogenezis és a lipogenezis tanulmányozásához a zsírszövet fejlődésében. Korábbi, sertés 8-10. Vizsgálataink azt mutatják, hogy a szterin - szabályozó elemet megkötő 1c transzkripciós faktor (SREBP1c) expressziója, amely egy fontos transzkripciós faktor, amelyről ismert, hogy modulálja a transzkripciós lipogén zsírsav szintetázt, amelyet a sertésmájban és a zsírszövetben többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA) gátolnak. . A sertés SREBP1c expressziója in vivo és in vitro csökkentette a PUFA-t, hasonlóan más fajokhoz, például az emberhez és az egérhez 11-13. Ezek a sertés in vitro vizsgálatok elsősorban a sertés ADSC-ből (pADSC) származó differenciált adipocitákon folynak. Ezért ez az elsődleges sejttenyészet, a pADSC megbízható sejtrendszerként alkalmazható zsírszövet-fejlesztésként vagy más őssejt-alkalmazások tanulmányozására.

Jegyzőkönyv

MEGJEGYZÉS: Ezt a módszert gyártották és használták olyan kutatásokban, amelyekről korábban 14-17-ig számoltak be ebből a laboratóriumból; az idő múlásával a módszertan megváltozott. A jelenlegi eljárást egy malacból (7–9 napos) hajtottuk végre, vetőmagként 6 lyukú szövettenyésztő lemezekre, átlagosan 60 g sertés szubkután zsírszövetre. Minden eljárást szobahőmérsékleten hajtottunk végre, hacsak másképp nincs meghatározva. Minden állatkísérletet a Tajvani Nemzeti Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (IACUC) hagyott jóvá.

1. Készítse elő az emésztőközeget

Szerezzen szubkután zsírt a nyakból és a hátból; Malaconként (7–9 napos) 40–80 g, a sertések méretétől függően. Itt használjon 60 g disznóból nyert szubkután zsírszövetet.
Emésztőközeg előkészítése: lemérjük a kollagenáz II port összesen 54 000 egységgel, és feloldjuk 90 ml Dulbecco-módosított Eagle táptalajban (DMEM, 60 g zsír) 100 ml-es szerológiai palackban (900 egység kollagenáz/1,5 ml DMEM/g zsír ).
A sterilizáláshoz óvatosan keverjük, hogy legalább 15 percig feloldódjon, majd az emésztőközeget 0,22 um-es szűrőn engedje át, hogy az emésztőközeget rázóasztalon (100 fordulat/perc) vigye át. Használat előtt 4 ° C-on tárolandó.

2. Bontsa ki a szubkután zsírszövetet a disznóból

1. ábra Egyedi vágógép a Az alkalmazott pADSC izolálása. A diszektált zsírszövet a sertés karaj szubkután zsírszövetéből, amely a zsírrétegből és a hozzá kapcsolódó bőrrétegekből áll. Vágógépre van szükség a zsírréteg körülbelül 1 mm vastagságának levágására, elkerülve a bőrrétegek túlvágását. Balról jobbra: alátét tartó, szeletelő alátét, szénacél vágókés és csavarok. Szeletelő kés behelyezve a szelet tartó és a szeletelő párna közé összeszereléskor. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

3. A pADSC gyűjtése a sztróma-vaszkuláris frakcióból

Az emésztett zsírszövetet tartalmazó emésztőközeget egyetlen sifonrétegen vezetjük át tiszta, sterilizált 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban vagy 250 ml-es szerológiai lombikban. Fogóval nyomja meg a sifon közepét, hogy irányítsa és támogassa az emésztés áthaladását.
A sifont leengedje és csavarja fogóval a teljes áthaladás érdekében.
Az emésztőközeget elosztjuk négy 50 ml-es kúpos centrifuga csőbe (

4. Az őssejt felszíni markerek azonosítása pADSC-ből áramlási citometriával

5. A pADSC differenciálása adipocitákra, oszteocitákra és kondrocitákra

6. Differenciált adipociták, oszteociták és kondrociták festése

Reprezentatív eredmények

A sertés hátsó szubkután zsírszövetéből származó pADSC-t a tenyésztőlemezekre vagy -csészékre vetettük, és 2. A stroma vaszkuláris frakciójából származó pADSC morfológiája hasonlónak bizonyult az egér vagy az ember által nyert ADSC-hez. Huszonnégy órával a vetés után a szubkonfluens pADSC megfelelt és kibővített fibroblaszt-szerű morfológiával rendelkezik (2A). A pADSC 72 órán belül összefolyik és készen áll az adipocitákra vagy más mezenhimális típusú differenciálódásra (2 B). A pADSC kémiai indukció után erős adipogén potenciált mutat, és az érett adipociták 9 nap elteltével eltérhetnek, a pADSC-k több mint 90% -a adipogén differenciálódást mutat (2C. Ábra) hogy figyeljék.

A pADSC e protokollban feltárt tulajdonságainak kezelése érdekében a pADSC felületi markereit áramlási citometriás elemzéssel értékeltük. Mint a 3 látható van , A mesenchymális őssejtek felületi markerei, köztük a CD29, CD44, CD90 és MHC I (vagy HLA I), erősen expresszálódtak. Negatív felületi markerek, például CD4a, CD31, CD45 és MHC II (vagy HLA II) alig voltak kimutathatók a protokollban levezetett pADSC-ben (3. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ezek a pADSC mezenchimális típusú őssejt tulajdonságokat mutatnak, anélkül, hogy jelentős endotheliális vagy hematopoietikus őssejt szennyeződnének, beleértve a myeloid vagy nyirokprogenitorokat.

Annak biztosítására, hogy a pADSC a mezenhimális őssejteket képviselje, a pADSC multipotenciáját adipocitákra, oszteocitákra és kondrocitákra történő differenciálással vizsgáltuk. Ezeket az adipocitákat, oszteocitákat és kondrocitákat specifikus színezékekkel, olajvörös O, alizarin vörös S, illetve toluolid kék O festékkel festették. (4. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy ez a protokoll olyan pADSC-ket eredményezett, amelyek megőrizték a mu-tipotenciát, teljes tulajdonságokkal, hasonlóan a mesenchymal típusú prekurzorokhoz.

2. ábra A pADSC morfológiája a sertésháti zsírrégióból. (A) A szubkonfluens pADSC beragadt és elterjedt 24 órás vetés után egy 6-lyukú tenyészlemezen. (B) 72 órás vetés után a pADSC egy 6 üreges tenyészlemezen összefolyik. (C) Az érett adipocitákat 9 napos pADSC adipogén differenciálódás után figyeltük meg. A 100-szoros nagyítással készített képek fáziskontraszt mikroszkóppal készültek. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

3. ábra Az őssejt azonosításaFelületi jelölők a pADSC számára. 1 x 105 pADSC-t specifikus antitestekkel hajtottunk végre, és áramlási citometriás analízissel elemeztük az őssejt-markereket. A számok a festett sejtek százalékos arányát jelzik a populációban (vörös) a nem festett kontrollhoz viszonyítva. Az x tengely a relatív fluoreszcencia intenzitást képviseli. Az y tengely a sejtek populációját képviseli. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

4. ábra A multipotens pADSC differenciálása. A pADSC multipotenciáját úgy határoztuk meg, hogy a pADSC-t differenciáltuk (A) Adipociták meghatározva, (B) Osteociták (C) Kondrocitákat és reprezentatív festékekkel, olajvörös O-val, Alizarin Red S-rel és toluolid-kék O-val festettük. Képek voltak (A) vett 100 x (B) 200 x, és (C) 100x-os nagyítás fáziskontraszt-mikroszkóppal. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Vita

Itt bemutatunk egy megbízható sejtrendszert a zsírszövet fejlődésének tanulmányozására a pADSC primer sejttenyészetében. Más halhatatlan sejtvonalakhoz képest ez a módszer kényelmes módot kínál nagy mennyiségű, kiváló minőségű felnőtt mesenchymális őssejtek izolálására, amelyek felhasználhatók az adipociták vagy más mesenchymális vonalak differenciálódási folyamatainak tanulmányozására az állatok fejlődésével kapcsolatban in vivo. A módosított protokoll kritikus lépése az, hogy levezethetjük a pADSC-t egy 7–9 napos malacra, mert az idősebb sertésekhez képest könnyű kezelni a kismalacokat, és hasonlóan más fajokhoz 19,20 A hozam és a multipotencia pADSC csökken, ha a sertések 21 évesek.

A potenciális őssejtforrások közé tartoznak az embrionális őssejtek (ESC), az indukált pluripotens őssejtek (iPS) és a postnatalis felnőtt őssejtek. A felnőtt multipotens őssejtek közé sorolt ADSC korlátozása az, hogy a felnőtt őssejtek multipotenciája a divergens törzsek differenciálódásában viszonylag korlátozott az ESC-hez vagy az iPSC-hez képest. Az ESC levezetésére és az iPS onkogén tulajdonságaira vonatkozó etikai kérdések azonban korlátozzák az ESC és az iPSC 22,23 használatát. Emiatt számos kutató a felnőtt őssejtekre összpontosított a pluripotencia javítása érdekében. A felnőttkori mesenchymális őssejtek (MSC) régóta vizsgált leggyakoribb oka a csontvelőből származó mesenchymalis őssejtek 24. A csontvelő betakarítását azonban viszonylag fájdalmas eljárásnak tekintjük. További probléma, hogy az őssejtek hozama a csontvelőből véges. A csontvelő átlagosan 6x106 sejtmagot szív fel/ml, és az MSC csak az összes sejtmaggal 0,001-0,01% -ot képvisel. Miután megvizsgálta ezeket a hátrányokat, az ADSC-t kevésbé tolakodó forrásként javasolják 25,26 multipotens őssejt előállításához.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak a laboratórium minden tagjának a részletes megbeszélésért, és kifejezik a technológiai támogatást ebben a protokollban. A laboratóriumban végzett kutatást a Tudományos és Technológiai Minisztérium támogatásai (MOST 103-2314-B-002-126 és MOST 102-2313-B-002-026-MY3), valamint az Aim által a felsőbb egyetem támogatásával támogatták. -Plan támogatott (104R350144) Tajvani Nemzeti Egyetem.