Az ATP13A2 variánsok azonosítása és jellemzése, valamint azok relevanciája a
Az ATP13A2 variánsok azonosítása és jellemzése, valamint azok jelentősége a neurodegeneratív betegségek szempontjából Induló értekezés a kölni egyetem matematikai és természettudományi karának doktori fokozatának megszerzéséhez André Heimbach, Essen Köln 2009
Jelen dolgozat a Kölni Egyetem Matematikai és Természettudományi Karának jóváhagyásával jelent meg a Kölni Egyetem Humángenetikai Intézetében (igazgató: Prof. Dr. Brunhilde Wirth) Prof. Dr. irányításával. Thorsten Hoppe és Prof. Dr. Christian Kubisch készítette. Lektor: Prof. Dr. Thorsten Hoppe Prof. Dr. Christian Kubisch Az utolsó szóbeli vizsga napja: 2010. január 12
Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék Rövidítések listája 1 Bevezetés 1 1.1 Neurodegeneratív betegségek 1 1.1.1 Parkinsonizmus 1 1.1.2 Kufor-Rakeb-szindróma és ATP13A2 5 1.2 P-típusú ATPázok 6 1.2.1 Anyagszállítás biológiai membránokon keresztül 6 1.2.2 ATP-meghajtású szivattyúk 6 1.2.3 A P típusú ATPázok szerkezete 7 1.2.4 A P típusú ATPázok funkcionális mechanizmusa 8 1.2.5 A P típusú ATPázok osztályozása 10 1.2.5.1 I. típusú ATPázok 11 1.2.5.2 II. Típusú ATPázok 11 1.2.5.3 III. Típusú ATPázok 11 1.2. 5.4 IV. Típusú ATPázok 12 1.2.5.5 V. típusú ATPázok 12 1.2.6 ATPáz mutációk mint betegségek oka 13 1.3 A munka céljai 15 2 Anyagok és módszerek 16 2.1 Vegyszerek 16 2.2 Fogyóeszközök 16 2.3 Általános megoldások 16 2.4 Enzimek 17 2.5 Kereskedelmi reagens rendszerek ( Készletek) 17 2.6 Dezoxiribonukleotid-trifoszfátok (dntp) 17 2.7 Klónozó vektorok 18 2.8 Használt eszközök 18 2.9 Adatbázisok és más webhelyek 19 2.10 Szoftver 20 2.11 Molekuláris biológiai módszerek 20 2.11.1 Polimeráz láncreakció (PCR) 20 2.11.2 Alapozó kialakítása 20 2.11.3 PCR reakció tételek 21 I
Rövidítések listája Rövidítések listája A abszorpció A adenin AA aminosav A. desztillált víz ábra. Ábra AK antitest ABI Applied Biosystems AP alkalikus foszfatáz ATP adenozin trifoszfát BAC baktérium mesterséges kromoszóma BCA bicinchonininsav (bicinkoninsav; 2,2-kinolin-4,4-dikarbonsav) bp bázispár BSA szarvasmarha-szérumalbumin (szarvasmarha-szérumalbumin) C-citozin cdna RNS comp-het vegyület-heterozigóta DAPI 4 6-diamidino-2-fenilidol-ddntp-dideoxinukleotid-trifoszfát DNS-másolata 5 trifoszfát dpc nap coitum után DTT Detiotreitol E. coli Escherichia coli EDTA Etilén-diamin-tetraecetsav EF embrionális tápláló sejtek (egér) ER endoplazmatikus retikulum ES embrionális őssejtek (egér) F előre primer (primer előre irányban) F F c FCS G. G antigénkötő Az antitest konstans arányú töredéke az antitest f etal borjú szérum guanin gramm V
Rövidítések listája h óra HCl sósav HEK emberi embrionális vese (emberi embrionális májsejtek) het heterozigóta hom homozigóta HRP torma-peroxidáz (torma-peroxidáz) H 2 O víz IgG immunglobulin a G csoportból IgM immunglobulin az M csoport IHF integrációs gazda tényező J Joule k kilo kb kilobázispárok kda kilodaltonok KO kiütés KRS Kufor-Rakeb szindróma 1 liter LAMP lizoszómához kapcsolódó membránfehérje LB Luria Bertani m milli (faktor 10-3) M moláris ma milli-amper Mb megabázispár perc perc MMC mitomicin C MOPS 3-N-morfolino-propánszulfonsav MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin MTT 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium-bromid n-nano (10-9. Faktor) N normál NaCl-sóoldat NADH nikotinamid-adenin-dinukleotid NADPH-nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát NaOH-nátrium-hidroxid-oldat Neo neomicin OD n optikai sűrűség (abszorbancia n nanométeres hullámhosszon) p pico (10-12 faktor) VI
Rövidítések listája PAA PAGE PCR PD PDI ph PIC R rh RNase rpm RT SDS sec T TAE Taq TE TM U UPS UV V WT w/v poliakrilamid poliakrilamid gél elektroforézis polimeráz láncreakció Parkinson-kór (Parkinson-kór) fehérje-diszulfid-izomeráz negatív dekadikus logaritmusa a hidrogénion-koncentráció proteázainak - Inhibitor koktél reverz primer (primer fordított irányban) relatív páratartalom (relatív páratartalom) ribonukleáz fordulat/perc (fordulat/perc) szobahőmérséklet nátrium-dodecil-szulfát másodperc timin-trisz-acetát-EDTA Thermus aquaticus Tris-EDTA transzmembrán domén egység - az enzimaktivitás egysége ubiquitin- A Proteasome rendszer ultraibolya fénye a vad típusú tömeg térfogatát adja meg VII
Anyag és módszerek 2. Anyag és módszerek 2.1 Vegyszerek Vegyi anyagokat, szerves anyagokat és oldószereket, minőségi megnevezés pro analízissel alkalmaztunk és az alábbi vállalatoktól szereztük be: Amersham (Freiburg) AppliChem (Darmstadt) BD Biosciences Clontech (Heidelberg) Calbiochem (Darmstadt) Difco Lab (Sparks/USA) Fermentas Life Sciences (St. Leon-Rot) Fluka (Taufkirchen) GE Healthcare (München) Invitrogen (Karlsruhe) Merck (Darmstadt) New England Biolabs (Frankfurt am Main) Perkin Elmer (Massachusetts/USA) Pierce (Rockford/USA) Roche (Mannheim) Sigma-Aldrich (Taufkirchen) 2.2 Fogyóeszközök Műanyag árukat és reakcióedényeket a Greiner (Frickenhausen) és a Sarstedt (Nümbrecht) cégektől szereztek be. 2.3 Általános megoldások Ha a protokoll másként nem rendelkezik, desztillált vizet (A. dest) használtunk minden pufferhez, oldathoz és közeghez. TE puffer (ph 8) 10 mm Tris-HCl 1 mm EDTA és 500 ml HPLC-H 2 O, steril szűrő, -20 C-on tárolható TE -4 puffer (ph 8) 10 mm Tris-HCl 0.1 mm Na 2 -EDTA steril szűrő, tárolás -20 C-on 10x PBS (ph 7,4) 80 g NaCl 2 g KCl 14,4 g Na 2 HPO 4 2,4 g KH 2 PO 4 autokláv 1 l H 2O-ig, Tárolás RT 16-on
Anyag és módszerek 2.7 Klónozó vektorok 2.2. Táblázat: Használt vektorok (vektor térképek a függelékben) Név Leírás Méret [bp] Forrás pcdna 3.1 V5/His expressziós vektora 5523 Invitrogen pdonr221 Klónozó vektor 4762 Invitrogen pcdna-dest53 Expressziós vektor 7767 Invitrogen PPNT célzó vektor 7200 AG Zimmer pdonr221 -Vektor 7314 AG Brüning 2.8 Használt készülékek 2.3. Táblázat: Használt technikai eszközök Készülék modell Gyártó Autokláv gőzsterilizáló Varioklav H + P Laboratóriumi technológia Inkubátor Hera Cell 150 termoelektroforézis kamra Sub-Cell GT Bio-Rad X-Cell Sure Lock Invitrogén elektroporációs készülék Génlökő rendszer Biorad kapacitás Extender Biorad fejlesztőgép Curix 60 Agfa Geiger számláló LB 124 Berthold gél dokumentációs rendszer Chemidoc XRS Biorad fűtő/keverő lemez MR 3001 Heidolph hibridizációs szekrény, 30-as típusú speciális Hyb Bachofer inkubációs rázógép Innova 44 mikroszkóp Axioplan2 Zeiss nukleinsav/fehérje mérő eszköz Nano Drop ND-1000 New Brun S. tudományos PeqLab ph mérő inolab ph 1. szint WTW pipettázási segédanyag Kutatás Eppendorf Valós idejű PCR rendszer Easypet 7500 Valós idejű PCR rendszer (Taq-Man) Eppendorf ultratiszta vízrendszer Milli-Q; Q-Gard 2 Millipore Roller Shaker hengerkeverő SRT 1 Stuart Applied Biosystems 18
Anyagok és módszerek Sequencer ABI Prism 3100 Genetic Analyzer Applied Biosystems Feszültségberendezések Power Ease 500 Invitrogen Power Pac Basic Bio-Rad steril munkaasztal Hera Safe KS 12 Kendro Thermoblock Heatblock II VWR Thermocycler icycler Biorad Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems Thermomixer Compact Epp IKA Benchtop centrifuga Galaxy Mini VWR átviteli modul X-Cell II blot modul Invitrogen ultrahangos fürdő USC 100T VWR ultracentrifuga Avanti J 20 XPi Beckman Coulter UV keresztkötő CL-1000 UV keresztkötés UVP UV kamra GS génmegkötő UV kamra Bio Rad Vortex Reax felső Heidolph mérleg Acculab Vicon Sartorius mérleg (precíziós mérleg) ARJ 120-4M Kern vízfürdő WB22 Memmert centrifuga centrifuga 5415D Eppendorf centrifuga 5415R Eppendorf Allegra X-22R Beckman Coulter Varifuge 3.0 RS Kendro 2.9 Adatbázisok és más weboldalak BACPAC Resources Center BDGP BioTooled Progresserver: wwwt. NEB P-típusú ATPases UCSC Vector Designer http://bacpac.ch ori.org/ http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html http://biotools.umassmed.edu/tacg/wwwtacg.php http://www.cbs.dtu.dk/services/ http: //www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.neb.de http://biobase.dk/
exe/patbase.html http://genome.cse.ucsc.edu/index.html https://vectordesigner.invitrogen.com/login.cfm 19