Az emberi zsírszövet mikrovaszkuláris funkciójának értékelése Videomicroscopy Protocol segítségével

Összegzés

Videomikroszkópos rendszereket használnak az izolált zsírszöveti arteriolák funkcionális tulajdonságainak tanulmányozására fiziológiai és farmakológiai ingerekre reagálva. Ezzel a technikával mikrovaszkuláris fenotípusok vizsgálhatók elhízott emberek különböző zsírszöveti doménjeiben.

Absztrakt

Bevezetés

Laboratóriumunk videomikroszkóppal vizsgálja az elhízás és az érrendszeri rendellenesség kapcsolatát, különös hangsúlyt fektetve a különféle zsírszöveti domének érrendszerre gyakorolt ​​hatására. Az intraabdominális zsigeri zsír felhalmozódásával járó központi elhízás valószínűleg adipocytokin termeléssel, anyagcserezavarokkal és kardiometabolikus kockázattal jár. Feltételezték, hogy a pro-atherogén citokinek túltermelésével járó zsírszövet-diszfunkció és az adipokin-diszreguláció erősen érintett ezekben a folyamatokban, de bizonyos szabályozó molekulákat és kezelési célokat nagyrészt nem fedeznek fel. 4 Egyébként a helyi zsírszövet szintjén a kapilláris elvékonyodása és a károsodott véráramlás összefüggésbe hozható a zsírszövet pszeudohipoxiával és a metabolikus diszregulációval. Az a hipotézis, hogy a szív- és érrendszeri betegségek valószínűleg a zsírszövet diszfunkciójának eredményeként alakulnak ki. A zsírból felszabaduló pro-atherogén mediátorok, különösen a közepes/zsigeri elhízás kapcsán, valószínűleg elősegítik az endotheliális diszfunkciót és a kórokozók vaszkuláris változásait, amelyek az itt leírt módszertan alkalmazásával lokálisan megnyilvánulhatnak a zsírérekben és a detektálásban. 5.

Az izolált zsírszöveti arteriolák funkcionális értékelése hasznos megközelítés annak a patofiziológiának és molekuláris mechanizmusainak megértéséhez, amelyek hozzájárulnak az ér elhízásakor bekövetkező vaszkuláris diszfunkcióhoz. A zsírraktár-specifikus diszfunkcióhoz hozzájáruló mechanizmusok vizsgálatához módszereket alkalmaztunk az endothelium-függő és -független vazodilatátor válaszok tesztelésére a mikrovaszkulumból, és értékeltük a különféle szabályozó jelöltek expresszióját kapcsolt zsigeri és szubkután (SC) zsírszövetmintákban Elhízott alanyok a bariatrikus műtét során.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az itt leírt protokollt és példákat a Bostoni Egyetem Orvostudományi Egyetem Intézményi Felülvizsgálati Testülete (IRB, H-25644. Számú protokoll) hagyta jóvá, és a Helsinki Nyilatkozattal összhangban készültek. Minden résztvevő írásbeli hozzájárulást adott a részvétel előtt.

1. Készítse elő az oldatokat és a mikropohár kanüleket

2. Készítse elő a reagenseket

  1. az acetilkolin előállítása (ah, 10-2 M, törzsoldat). 18,29 g anyagot 10 ml ionmentes vízben oldunk. A törzsoldat (10-2 M) 1 ml-es mennyiségeit -80 ° C-on mentesítjük. A kísérlet napján sorozatosan hígítva a következő üzemi koncentrációkat kapjuk: 10-5, 10-9, 10-6, 10-7, 10-8 st.
  2. Készítsük el a papaverint (2x10-2 M, törzsoldat). 0,07517 g anyagot 10 ml ionmentes vízben oldunk. Készítsen elő 10 µL alikvot részeket a törzsoldatból, és sorozatban hígítsa -80 ° C-on, hogy a kísérlet napján 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7 10 -8 M kapjon.
  3. Készítsük el az endotelin-1-et (ET-1, 2 x 10-5 M, törzsoldat). Oldjunk fel 50 µg endotelint-1 1 ml 1% BSA/PBS-ben. Takarítson meg 1 ml alikvot mennyiségű törzsoldatot (2x10-5 M) -80 ° C-on. Hígítsa a kísérlet napján, hogy a kísérlet napján 10-10 M munkakoncentrációt kapjon.
  4. Tárolja a reagenseket -20 ° C-on vagy -80 ° C-on a rendelkezésre álló fagyasztó típusától függően, de legfeljebb 6 hónapig.

3. A zsírszövet gyűjtése és az ér előkészítése

4. Az elhízott mikrovaszkuláris funkció értékelése

Megjegyzés: általában a zsíros arterioláris endothelium-függő értágulat indukálható fiziológiai (áramlás által indukált) és farmakológiai ingerekre (Ach által indukált) adott válaszként.

  1. Áramlás által közvetített, endothelium-függő értágulat
    1. nyomás után rögzítsük a nyugalmi állapotban levő zsíros arteriola átmérőjét (Di). Ezt hívjuk nyugalmi alapvonal átmérőnek.
    2. Előre az erek összehúzódnak,

    A nyugalmi alapvonal átmérőjének (Dp) 55% -a 1 µL endotelin-1 (ET-1, 10-10 M) hozzáadásával közvetlenül a fürdőkádhoz és 5 percig várakozás. Ismételje meg ezt a folyamatot, amíg el nem éri a kívánt folyamatot

    5. Adatok elemzése és számítása

    1. számítsa ki az érrendszeri reaktivitást. Használja a százalékos értágítást az adatok kinyomtatásához, vegye figyelembe az ér átmérőjének alapvonalbeli különbségeit, és számítsa ki a következő egyenlet segítségével:
      % Értágulat (DT-Dp/Di-Dp) x 100 =
      ahol DT a rögzített átmérő egy bizonyos ponton (maximális átmérő), Dp az érszűkítő szer hozzáadása után regisztrált átmérő (azaz az ET-1 okozta szűkítő átmérő), és Di az átmérő, amely közvetlenül az érszűkítő szer hozzáadása előtt volt (nyugalmi alapvonal átmérője) rögzítve. 9.
    2. Határozzuk meg az agonistával szembeni értágulat és érszűkület érzékenységet (dózis-válasz), mint Ach, Papaverin vagy ET-1 koncentrációját, amely a maximális válasz (EG50) 50% -át váltja ki, amelyet egy sigmoid paraméter határoz meg, és ábrázolják, ahogy azt korábban leírtuk. 10.
      MEGJEGYZÉS: A zsíros mikrovérek értágulatának megfigyelői között elvégzett reprodukálhatósági vizsgálatok laboratóriumunkban magas korrelációs együtthatóval (CC) 0,99 (n = 10 Schiff kísérletek).

    1. Expressz folyamatos mérések, mivel ± SEM azt jelenti, hogy ezek általában normális eloszlásúak. Elemezze a vaszkuláris reaktivitást a zsíros arteriolákban, ismételt hatású kétirányú ANOVA segítségével.
    2. Alternatív megoldásként hasonlítsa össze a kumulatív értágulat görbéje alatti területet (AUC) a kezelési csoportok közötti dózisválaszokkal. Minden esetben vegye fontolóra a P előfizetését. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Reprezentatív eredmények

    Laboratóriumunk videomikroszkópiával vizsgálta a zsírszövet endothelium-függő és -független értágulatát, valamint vazokontraktilis funkcióját, elhízott emberek szubkután és zsigeri zsírszövetéből izolált arteriolákat. A jellegzetes kísérleti beállítást az 1A. Ábra mutatjaMegjelenik. A zsírszöveti arteriolákat két kapilláris üveg pipetta közé szuszpendáljuk, és varratokkal rögzítjük a szervkamrában, az 1b ábra szerintLátható. Amint azt az 5.1 szakasz fent leírta, az arterioláris válaszokat azután ki lehet értékelni, hogy megvizsgáljuk az éret a kiinduláskor (2A. Ábra), amelyet előzetes szűkítés követ az ET-1-vel

    Az alapvonal átmérőjének 55% -a (2. ábra b), majd az agonista által kiváltott értágulat és az erek lumenének relaxációja a 2. ábra szerintLátható.

    mikrovaszkuláris
    1. ábra: A videomikroszkópia felépítése. (A.) A videomikroszkópos szervkamra alkotóelemeit ábrázoló kép. (B.) A szervkamrában két üveg kapilláris pipetta közé szerelt emberi zsírszöveti arteriola képe. Schiff átmérője a fiziológiai és farmakológiai ingerekre reagálva változik, amelyeket elemző szoftver és a rendszerre szakosodott inverz kamerarögzítés segítségével lehet megvizsgálni és számszerűsíteni. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

    zsírszövet
    2. ábra: A mikrovaszkuláris értágulat vizualizálása nyomás-video mikroszkóppal. (A.) nyugalmi kiindulási arteriolák átmérője (nyomás utáni átmérő, nincs agonista vagy stimuláció: kedd) (B.) már szűkített átmérők (indukált szűkített átmérők az ET-1 után: Dp), (C.) Az agonista által kiváltott átmérő csökkenés (az Ach hozzáadása után: DT). Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

    zsírszövet
    3. ábra: Endothelium-függő és -független vazodilatáció szubkután és viszceralis zsírszöveti arteriolákban túlsúlyos embereknél. Az endothelium-függő értágulat szignifikánsan gyengült a zsigeri szervekben a szubkután zsírszöveti arteriolákhoz képest (A.) A megnövekedett áramlás értékelése (párosított szubkután és zsigeri erek, n ​​= 20), vagy (B.) Az acetilkolin dózis-válasza L-NÉV-vel vagy anélkül (párosított szubkután és zsigeri erek, n ​​= 16). (C.) Az endothelium-független értágulat nem változott differenciálisan a zsigeri és a szubkután arteriolák között, amikor értékelték a papaverin dózis-válaszát (párosított szubkután és zsigeri erek, n ​​= 8). * A raktárak közötti csoportbeli különbségeket jelzi; † az L-NAME-tel rendelkező acetilkolin és a kizárólag acetilkolin közötti depó-specifikus különbségeket jelöli; NS: nem jelentős. Az adatok átlag ± SEM formában vannak megadva, p Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Vita

    Az elhízott arteriolák disszekciója és izolálása a környező szövetektől időigényes és munkaigényes folyamat lehet, a részletekre és a technikai protokollra alapos figyelemmel. A mikrodisszekciós eljárás gondos készségeket és speciális disszekciós kellékeket igényel annak elkerülése érdekében, hogy a mikrovaszkuláris sejt simaizom- vagy endothelrétege károsodjon. Az arterioláris fal legkisebb véletlenszerű szúrása is megakadályozhatja az intraluminális nyomást és sikertelen kísérletet eredményez. Ezenkívül az arteriolák varratokkal történő kanülezése kritikus fontosságú az arteriolák rögzítéséhez az edény mindkét végén az üveg-kapilláris pipetta csúcsai között.

    Az emberi szigetelő mikrohullámok spontán myogén tónus alakulhat ki 30-40 perc 60mmHg nyomáson történő nyomás után. Megállapítottuk azonban, hogy az emberi zsírarteriolák mérete általában 50-350 µm belső átmérőjű, viszonylag kicsi az erek simaizomsejtjeinek ritka rétegeivel, és nem hajlamosak jelentős myogén tónus kialakulására a vázizom arterioláihoz képest. Így ezeknek a kis arterioláknak az előzetes szűkülését indukáljuk az ET-1-vel az értágítóknak való kitettség előtt. Megállapítottuk, hogy az ET-1 megbízhatóbb érösszehúzó választ eredményez, míg egyes esetekben az alfa-receptor agonistákra, például a fenilefrinre adott válaszok változékonyságot mutathatnak. A kívánt kiváltásához elengedhetetlen a megfelelő agonista használata

    55% -os nyakkendő választás; Fontos azonban az előszűkítő szer megfelelő mennyiségének kiválasztása az adagolás helyett, hogy megakadályozzuk az ér mérgező károsodását. Ennek eléréséhez az alsó adagsorral kezdjük, és a titrálást a 4.1.2 szakaszban leírtak szerint végezzük.

    A zsírszövetben lévő arteriolák érzékenyek a pH és a hőmérséklet változásaira; Ezért elengedhetetlen a megfelelő pH (7,4) és hőmérséklet (37 ° C) ellenőrzése és ellenőrzése a kísérleti eljárás során. Míg a videomikroszkópia egy szigorúan szabályozott hőmérséklet-szabályozás, elengedhetetlen az oldat pH-jának figyelemmel kísérése a kísérletben, hogy elkerüljük az eltolódásokat, amelyek torzíthatják az eredményeket. A CANCER oldat és a helyettesítő oldat folyamatos buborékoltatása 15 percenként a nyomás és mosás során csökkenti a pH ingadozását az idő múlásával.

    A videomikroszkópia hasznos technika a mikrovaszkulatúra funkcionális tulajdonságainak tanulmányozásához, a technika jelentős tanulási görbével rendelkezik és potenciálisan munkaigényes, különösen az érrendszeri elszigeteltség folyamata során. A biopsziás szövet típusától függően a zsírszövet mikrovaszkulatúrával kapcsolatos tapasztalataink azt mutatják, hogy a kanülációs eljárás jelentős időt és türelmet igényelhet. Ezenkívül a kísérletek időbeli érzékenysége is benne rejlik, mivel a testen kívüli erek idővel elveszítik fiziológiai és funkcionális tulajdonságait. Tehát a kísérleteket az edények életképes ablakain belül kell elvégezni a műtéti biopszia után percektől órákig, mielőtt bármilyen szövetromlás következne be.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Közzétételek

    A szerzőknek nincsenek részletek vagy összeférhetetlenségek, amelyekről beszámolhatnak.

    Köszönetnyilvánítás

    A szerzők köszönetet mondanak az önkénteseknek, hogy részt vettek ezekben a tanulmányokban, és a Boston Medical Center sebészeti személyzetének, hogy zsírszöveti biopsziákat végeztek. Dr. Gökcét a National Institute of Health (NIH) Grants, HL081587, HL114675 és HL126141 támogatja. Dr. A Color az NIH K23 HL135394 támogatásra támaszkodik.