C-genotipizáló hepatitis vírus - Synevo
Általános információk és ajánlások
A hepatitis C vírus (HCV) globálisan elterjedt kórokozó, amely a morbiditás és a halálozás egyik fő oka. A legfrissebb becslések szerint a HCV szeroprevalenciája az elmúlt 15 évben 2,8% -ra nőtt, ami világszerte több mint 185 millió fertőzésnek felel meg. A tartós HCV-fertőzés májcirrhosis, hepatocelluláris carcinoma és magas halálozási arányú májelégtelenség kialakulásával jár.
A többi RNS vírushoz hasonlóan a HCV is jelentős genetikai sokféleséggel rendelkezik nukleotid szinten, ami nagy kihívást jelent mind a HCV vakcinák, mind a pangenotípusos terápiák kifejlesztése szempontjából.
A genomi szekvencia filogenetikai elemzése alapján a HCV-törzseket jelenleg 7 különálló genotípusba (HCV 1-7) sorolják, amelyek nukleotidszekvenciákban 30-35% -kal és több mint 50 altípusban különböznek egymástól. 15-25% -os különbséget regisztrál. Ezenkívül fertőzött egyénekben a HCV különféle víruspopulációk keverékeként kering és viselkedik, az úgynevezett kvázi-fajok 1; 2 .
A HCV genom olyan doménekből áll, amelyek nagymértékben különböznek a mutációk sebességétől és a nukleotidszekvenciák variálhatóságától. Így a nem lefordított régió a genom 5'-végén (5'UTR) a legjobban fennmaradt domén, a leglassabb evolúciós sebességgel. Ezután következik a fehérje nukleokapszid magot kódoló C (mag) gén, amely háromszor gyorsabban fejlődik az 5'UTR régióhoz képest. Az E1 és E2 burokfehérjéket kódoló gének alkotják a hipervariábilis régiót, amely izolátumokonként eltérő. Ez lehetővé teszi a vírus számára, hogy megkerülje a gazdaszervezet immunmechanizmusait, amelyek a vírusburokban lévő hozzáférhető fehérjék ellen irányulnak. .
A HCV általános prevalenciájáról szóló legfrissebb adatok szerint az 1. genotípus a legelterjedtebb (az összes HCV-fertőzés 46,2% -a), amelyet a 3. genotípus követ (30,1%); A 2., 4. és 6. genotípus felelős az esetek 22,8% -áért, az 5. genotípus pedig 1-ért .
Hazánkban az 1b genotípus, valamint az 1a és 1b 4 genotípus keveréke dominál. A bukaresti Matei Balş Intézetben 670 betegen végzett vizsgálat az 1-es genotípusú HCV 99,7% -os előfordulását jelezte 5 .
Az antivirális terápia célja a HCV-fertőzés gyógyítása. A tartós virológiai választ (SVR) egy nem kimutatható HCV RNS határozza meg 12 és 24 héttel a kezelés befejezése után. A HCV-fertőzés az esetek több mint 99% -ában gyógyul meg, amikor SVR-t kaptak. Cirrhosis nélküli betegeknél az SVR általában a májbetegség megszűnésével jár, míg a cirrhosisban szenvedőknél, bár a májfibrózis visszafejlődhet, és csökken a májelégtelenség és a portális hipertónia kialakulásának kockázata, a hepatocelluláris carcinoma kockázata nem teljesen szűnik meg.
2011-ig a kezelés a pegilezett interferon α és ribavirin kombinációján alapult, a válaszarány a HCV genotípustól függően eltérő volt. Ezzel a terápiás megközelítéssel Észak-Amerikában körülbelül 40% -os, Nyugat-Európában pedig 50% -os RVS arányt sikerült elérni az 1. genotípusú HCV esetében. Magasabb (akár 80% -os) RVS-arányt értek el a 2., 3., 5. és 6. genotípusnál, míg a 4. genotípusnál a köztes RVS-arányokat 6 .
2015 elején az Európai Bizottság engedélyezte egy új gyógyszer forgalomba hozatalát - Viekirax + Exviera, és engedélyezték a kezelést ribavirinnel vagy anélkül krónikus HCV 1-es genotípusú fertőzésben szenvedő betegek számára, beleértve a kompenzált májcirrhosisban szenvedőket, HIV-1 társfertőzötteket, opiátfüggőségi kezelés alatt álló és májtranszplantált betegeket. . Ezenkívül a gyógyszert ribavirinnel kombinálva engedélyezték krónikus hepatitis C genotípusú betegeknél. A Viekirax 150 mg paritaprevir (NS3/4A proteáz inhibitor) és 100 mg ritonavir (CYP3A4 inhibitor, amely növeli a paritaprevir) 25 mg ombitasvirral (NS5A inhibitor) kombinálva naponta egyszer, az Exviera pedig 250 mg dasabuvirt (nem nukleozid RNS-függő RNS-polimeráz inhibitor) tartalmaz naponta kétszer ribavirinnal vagy anélkül. . Az interferonmentes vírusellenes szerek ez a kombinációja szinergikusan célozza meg a HCV replikációját 3 különböző szinten. 6, III. Fázisú vizsgálat és 2, II. Fázisú vizsgálat eredményei szerint az 1. genotípussal fertőzött betegeknél a teljes SVR 12. héten meghaladta a 96% -ot 6; 7 .
Összefoglalva, a megfelelő protokoll kiválasztása érdekében ajánlott a HCV genotipizálását minden C vírusfertőzésnél a kezelés megkezdése előtt. .
A laboratóriumunkban elvégzett teszt RT-PCR technikát (a cél RNS reverz transzkripcióját komplementer DNS generálásával, amelyet PCR reakcióval amplifikálunk, az amplikon valós idejű detektálásával) és fluoreszcensen jelölt oligonukleotid szondákat alkalmazunk az egyes genotípusokra specifikusan a genotípusok azonosításához. HCV 1-6 és az 1 genotípus a és b altípusa 8 .
Begyűjtött minta - vénás vér 8 .
Betakarítási konténer - antikoagulánsként EDTA-t tartalmazó vakutainer 8 .
Betakarítás után szükséges feldolgozás - centrifugálással különítsük el a plazmát 8 .
A minta mennyisége - legalább 1 ml plazma 8 .
A minta stabilitása - a plazmaminták 1 hónapig stabilak -20 ° C-on 8 .
Módszer - Valós idejű PCR automatikus platformon m2000 (Abbott); a teszt amplifikációs célként használja a virális genom 5'UTR régiójából származó szekvenciát az 1-6. genotípus detektálására, és az NS5B régiót az 1a és 1b altípusok külön azonosítására; 4 primer készletet használnak, amelyek 3 különálló reakciót igényelnek:
- A reakció: kimutatja az összes HCV izolátumot, az 1a altípusú izolátumokat és a 3-as genotípusú izolátumokat;
- B reakció: a 2. genotípusú, az 1b altípusú és az 1. genotípusú izolátumokat detektálja;
- C reakció: a 4., 5. és 6. genotípusú izolátumokat detektálja.
Az egyes betegminták előkészítésekor egy olyan RNS-szekvenciát vezetnek be, amely nem kapcsolódik a HCV genomhoz, és amely a folyamat minden szakaszában belső kontrollként szolgál. Kontrollmintákat (pozitív és negatív) is használunk a minták minden egyes futtatásakor.
A teszt pontosságát 162 1-es genotípusú HCV-izolátum (110 1a genotípusú és 58 1b genotípus), 41 HCV 2-es, 27 HCV 3-as, 28 HCV 4-es, 14 HCV 5-ös genotípus elemzésével bizonyítottuk. és 12 izolált HCV 6. genotípus. A nukleinsav-szekvenálási technikát alkalmaztuk a referencia genotípus meghatározásához minden elemzett mintában. A két módszer (PCR genotipizálás és szekvenálás) közötti összhang az összes azonosított genotípus esetében 97,59%, az 1a altípus esetében 97,27% és az 1b altípus esetében 91,38% volt 8 .
Határértékek és interferencia
A HCV genotipizálása nem ajánlott a HCV fertőzés szűrésére vagy megerősítésére. A teszt csak akkor lehetséges, ha C> 500 NE/ml virémia van.
Az 1. genotípusú HCV genom 5’UTR régiójának megfelelő oligonukleotid szonda nem reagál keresztreakcióval a 6a altípus HCV-t tartalmazó mintákkal, de keresztreaktivitást mutathat a 6b altípussal és a 6-os genotípus néhány nem6a/6b altípusával.
Egyes esetekben értelmezhetetlen eredmények érhetők el a HCV genom szekvenciák heterogenitása, a vegyes fertőzések vagy a rekombináns HCV törzsek (ritka) létezése miatt .