Differenciálás és Proliferati Max Planck Társaság
Szív Fejlesztési és Újjáépítési Osztálya (Prof. Dr. Dr. Thomas Braun)
MPI a szív- és tüdőkutatáshoz, Bad Nauheim
(1) A sejtek differenciálódása és szaporodása a fejlődés és a regeneráció során
A differenciálás és a regeneráció molekuláris szabályozása a sérült és öregedő szívben
Az általános doktrína szerint a felnőtt szív differenciált kardiomiocitákból (szívizomsejtek) áll, amelyek már nem képesek osztódni. Mivel az emberi szív évtizedek alatt folyamatosan és hatékonyan tud működni, feltételeztük, hogy az egyes kardiomiociták is jelentős változások nélkül túlélik ezt az időszakot. Különböző vizsgálatok azonban kimutatták, hogy az öregedés és a szív károsodása elkerülhetetlenül a sejtek elvesztéséhez vezet az úgynevezett programozott sejthalál (apoptózis) következtében a későbbi szöveti változásokkal (nekrózis). Ebből arra lehet következtetni, hogy a felnőtt kardiomiociták továbbra is képesek maradni az önmegújulásra, és ez elengedhetetlen a normális szívműködés fenntartásához. Eddig nem ismert, hogy mely jelek és folyamatok határozzák meg az egyensúlyt a sejthalál, a sejtek túlélése és a sejtosztódás között.
A szív- és tüdőkutatás MPI munkacsoportja Bad Nauheimben olyan növekedési tényezőket keres, amelyek képesek lennének kontrollálni ezt a kényes egyensúlyt. Ezen tényezők egyike valószínűleg a BMP-10, a BMP család új tagja (csontmorfogenetikus fehérjék), amelyet kifejezetten a trabekuláknak nevezett izomgolyók fejeznek ki a szívszövetben és a fejlődő egér szív pitvarában. A homozigóta mutáns BMP-10 egereknél a szív korai diszfunkciója alakul ki, ami különösen a trabekuláció hiányának tudható be, ami a mutáns embriók E10,5 és 11,5 p.c. közötti pusztulásához vezethet. (utánzás után) vezet. A szövetkultúrában a BMP-k a kardiomiocitákat is megvédik az apoptózistól. Mivel a BMP-10 erősen expresszálódik a felnőtt egér és emberi szívekben, a kutatók elemzik a BMP-10 szerepét a kardiomiocita túlélésében és az öregedésben transzgénikus egér modellekben. Arra számítanak, hogy a BMP-k szerepének mélyebb megismerése új terápiás módszerekhez vezet a szívbetegségekben (1. ábra).
Az öregedő vagy sérült szív helyreállítási folyamatait a nem funkcionális hegszövet képződése jellemzi. Az öregedő szívek regenerálása - amint azt a fentiekben kifejtettük - a felnőtt szívizomsejtek osztódási képességének korlátozása és a szív őssejtjeinek elegendő mennyiségének hiánya miatt nem lehetséges. Az MPI tudósai ezért a sejtgépezet manipulálásával próbálják megtörni a kardiomiociták mitotikus blokkját. Különösen az E2F transzkripciós faktorok és a telomeráz enzim katalitikus alegységének szerepét vizsgálják a sejtciklus megindításában, valamint a p53 és p73 domináns negatív verzióinak potenciális alkalmazását a szívizomsejtek apoptózisának megakadályozására.
Kutatók: Izrella Pietrowska, Thomas Kubin, Zhipei Liu
A kép felső részén egérszív látható, miután a koszorúér LAD-t lekötöttük. Az artéria kötése jól látható, hatalmas szívrohamhoz vezet. A kép alsó részén egy adenovírust injektáltak a szívbe, amely egy riporter gént fejez ki, amely egyszerű kék színnel láthatóvá tehető. A géntranszfer a szívszövetbe a jövőben a szívelégtelenség kezelésének lehetőségét jelenti.
A zöld gőte szívregenerációja (Notophtalmus viridescens)
Egyes szervezetek képesek arra, hogy más fajokban posztmitotikus sejteket újra belépjenek a sejtciklusba, és akár teljes szerveket vagy szervrészeket is regeneráljanak. Ennek az állatcsaládnak egy jól ismert tagja a gőte Notophtalmus viridescens, aki ismert amputált végtagok vagy farok és néhány más szerkezet regenerálásának képességéről. N. viridescens azon kevés gerincesek egyike, amely képes a szívizomszövet regenerálására is (2. ábra). A bad nauheimi MPI tudóscsoportja összehasonlítja a sértetlen és regeneráló szívszövet expressziós profilját annak érdekében, hogy azonosítsa azokat a molekulákat, amelyek szabályozzák a gőte szívének regeneratív képességét. Ennek a szűrésnek az adatait összehasonlítjuk a myocardialis infarctus egérmodelljének hasonló képernyőinek eredményeivel. Eddig a kutatók 100 000 cDNS-sel rendelkező DNS-chipeket állítottak elő, és azok segítségével azonosították azokat a géneket, amelyek differenciál expressziót mutatnak a regeneráló és nyugalmi szívben. A gócban a szív regenerálódását meghatározó molekuláris út részletes funkcionális elemzése a következő lépés, amelyet jelenleg különböző megközelítések alkalmazásával hajtanak végre.
Kutatók: Thilo Borchadt, Julia Kruse, Thomas Kubin, Thomas Böttger, Rene Zimmermann
Megjelenik egy „piros pöttyös, zöldes vizű gőte” (Notophtalmus viridescens), amelyben a szív egy része megsérült (a terület fehér színű). A sérült területen gyakorlatilag hiányzó ép szívizomsejteket zöld színnel színeztük. Az emberektől eltérően a gőte újjáépítheti a sérült területet, és felnőttkorban egy teljesen normális szívet is.
A kardiomiociták differenciálódását szabályozó gének azonosítása
Különböző géneket azonosítottak a múltban, amelyek hozzájárulnak a kardiomiociták differenciálódásához és a szív morfogeneziséhez. Ennek ellenére nagyon valószínű, hogy lényegesen nagyobb számú gén játszik szerepet a szív sajátos alakjában. Az ilyen gének azonosítására átfogó funkcionális megközelítések még nem léteznek emlősöknél. Az MPI egyik kutatócsoportja az embrió őssejtjeinek differenciálásán alapuló széles spektrumú genom stratégiát alkalmaz. Komplex retrovirális siRNS könyvtárakkal azonosítja azokat a géneket, amelyek döntő szerepet játszanak a kardiomiociták differenciálásában. Az azonosított géneket az embrionális őssejtek (ES sejtek) differenciálásában használják in vitro embrioid testek (EB-k) képződésével; 3B. Ábra) és in vivo tetraploid aggregált kimérák alkalmazásával.
Kutató: Andre Schneider, Thomas Böttger, Dietmar von der Ahe
Az embrionális őssejtek (ES) differenciálása kardiomiocitákká az embrionális testek (EB) három napos FGF-2 növekedési faktorral történő kezelése után. A: differenciálatlan sejtek; B: embrionális testek 3 napos FGF-2 kezelés után; C: Sarcomere MyHC (MF-20) pozitív kardiomiociták differenciálódtak az embrionális testektől 3 ng/ml FGF-2 kezelés után.
A szív öregedése és oxidatív stressz: SIR-gének és az energia-anyagcsere szabályozása
A reaktív oxigénfajok (ROS = oxigéngyökök) degeneratív változások sokaságát idézik elő a sejtben, és idő előtti öregedéshez vezetnek. Általában a ROS felhalmozódását tekintik a megnövekedett sejtöregedés fő okának. A főként posztmitotikus sejtekből álló szövetek különösen érzékenyek a ROS által okozott károsodásokra, mivel csak korlátozott mértékben képesek regenerálódni. Eddig az oxidatív stressz és az öregedés közötti pontos kapcsolat nem teljesen ismert 4. ábra. Egyértelmű azonban, hogy a megnövekedett oxidatív stressz instabilitáshoz vezet az energia-anyagcserében. A kiegyensúlyozatlan energia-anyagcsere valószínűleg a SIR (néma információszabályozó) géncsalád aktivitásának csökkenéséhez vezet. A SIR gének feltehetően inaktiválják a speciális kromatintartományokat (a NAD-függő hisztonok dezacetilezésén keresztül), és ezáltal védő funkciót töltenek be. Ezen elképzelés szerint az SIR2 élesztőben való túlzott expressziója (Saccharomyces cervisiae) az élettartam jelentős növekedésére.
Az MPI for Heart and Lung Research tudósai különféle egérvonalakat állítottak elő, amelyek lehetővé teszik számukra az oxidatív stressz, az öregedés és a kromatin inaktiváció szerepének vizsgálatát. Erre a célra felépítették a SOD2 (szuperoxid-diszmutáz) feltételesen aktív allélját, amely lehetővé teszi a gén bizonyos időpontokban inaktiválását és aktiválását a szívizomban. Egy második kísérletsorozatban a SIR2 cDNS mesterségesen túlexpresszálódik a szívben. Továbbá kutatják a normál kalóriatartalmú és hipokalorikus ételek hatását az oxidatív stresszre és a sejtek öregedésére a kardiomiociták megfelelő expressziós profiljainak felhasználásával. Azt is elemzik, hogy milyen összefüggés van az oxidatív stressz és a gén-kromatin inaktiváció között, azáltal, hogy keresztezik a SOD2-hiányos egereket azokkal, amelyekben az SIR2 túlzottan expresszálódik.
Kutatók: Eva Bober, Susanne Weinlich, Olesya Vakrusheva
A "manganizált szuperoxid-diszmutáz (MnSOD)" enzim hiperoxikus körülmények között növeli a fibroblasztok túlélési arányát. A kontroll fibroblasztokat és az MnSOD túlexpresszáló sejteket normál (20% O2 = "normoxia") és hiperoxikus (85% O2 = hiperoxia) körülmények között tenyésztettük. A fáziskontrasztos képek jelentősen magasabb túlélési arányt dokumentálnak oxidatív stressz alatt az MnSOD-túlexpresszáló sejtekben. Az MnSOD túlexpressziót a zöld fluoreszcencia alapján ismerhetjük fel (bal oldali és középső). A kép jobb oldala: A kék szín a sejtek indukált öregedését (öregedését) dokumentálja 200 nM doxorubicin beadása után. Azokban a sejtekben, ahol az MnSOD túlzott mértékű expressziót mutat, az öregedés nagymértékben megakadályozott.
Az izom prekurzor sejtek migrációjának ellenőrzése a sejtből induktív és autonóm jelekkel
A migráció a myogén sejtek (izomprekurzor sejtek) fontos tulajdonsága az organogenezis és a szervregeneráció során. A múltban a kutatók képesek voltak kimutatni, hogy a Homeobox Lbx1 gén sejt autonóm módon szabályozza a végtagok izomprekurzor sejtjeinek migrációját. Eredményeik bebizonyították, hogy az Lbx1 az izom prekurzor sejtek vándorlásának egyik legfontosabb szabályozója, és szükséges a hátsó végtag izmainak prekurzor sejtjeinek és az elülső végtag izomzatának célzott migrációjához (5. ábra). A heterozigóta és homozigóta mutáns Lbx1 sejtek cDNS-kivonásával a tudósok képesek voltak azonosítani az Lbx1 feltételezett célgénjeit. Ezen gének funkcionális vizsgálata jelenleg folyamatban van. Ezenkívül a munkacsoport megvizsgálja a jelátviteli kaszkádokat, amelyek szükségesek a sejtek mobilitásához és az izomprekurzor sejtek vándorlásához felnőtt egerekben és csirke embriókban.
Kutatók: Stefan Günther, Svetlana Oustanina
Az Lbx1 Homeobox gén deaktiválása az izom prekurzor sejtek végtagokba történő migrációjának leállításához vezet. Célzott mutagenezissel bakteriális riporter gént vezettünk be az Lbx1 génbe. Ez a genetikai trükk egyrészt kikapcsolja az Lbx1 gén aktivitását, másrészt pedig láthatóvá teszi azokat a sejteket, amelyekben az Lbx1 normálisan jelen lenne. Az első és a harmadik sor homozigóta mutánsokat, a második és a negyedik sor heterzigóta mutánsokat mutat. A c és i képeken jól látható, hogy a kékkel jelölt izom prekurzor sejtek nem vándorolhatnak a hátsó végtagokba, hanem "elakadhatnak" a csomagtartóban.
A testtömeg és a szívműködés szabályozása idegi bHLH gének révén
Néhány évvel ezelőtt a bad nauheimi MPI kutatói számos különböző cDNS-t és gént azonosíthattak az idegsejtekben expresszált bHLH gének (transzkripciós faktorok, amelyek tartalmaznak egy alapvető spirál-hurok-spirál domént) átvilágítás során. Különösen a két NSCL1 és NSCL2 gént elemzik. Bár az NSCL1 inaktiválása nem eredményezett észrevehető neuronális diszfunkciót, az NSCL1-mutáns egerek idő előtt elpusztulnak, feltehetően a vegetatív diszfunkció által kiváltott szívműködési zavarok következtében. Az NSCL2-hiányos egerek szintén több neuroendokrin rendellenességben szenvednek (6. ábra). Mindkét gén együttes inaktiválása csökkent idegsejt-proliferációhoz és károsodott differenciálódáshoz vezet a szaglóhámban.
A kutatókat érdeklik azok a molekuláris és fiziológiai folyamatok, amelyek ezeket a fenotípusokat megalapozzák. Különös figyelmet fordítanak az NSCL1 és NSCL2 célgének elemzésére, valamint a sejtproliferáció és a differenciálódás kapcsolatára. A projekt jövőbeni tevékenységeinek egyik fókusza az NSCL2 funkciójának vizsgálata a felnőtt szervezetben, valamint a szívritmus rendellenességek és vegetatív diszfunkciók mechanizmusának vizsgálata az NSCL1 mutánsokban.
Kutató: Karen Ruschke, Thomas Schmidt
Elhízás az idegrendszer diszfunkciója miatt: Az idegsejtekben kifejezett NSCL-2 bázikus hélix-hurok-hélix transzkripciós faktor célzott inaktiválása egerekben kifejezett elhízáshoz vezet. Az egér megjelenése molekuláris aláírása tekintetében hasonlít az emberi Prader-Willi szindrómára.
(2) A szövetek regenerációjának javítása és felgyorsítása: a sérült szív- és vázizomsejtek helyreállítása és pótlása
A regeneratív orvoslás a biológiai és az orvosi kutatás új és izgalmas területe. Közvetlenül a sejtek differenciálódásával és fejlődésével kapcsolatos alapkutatások eredményein alapul. Újabb megállapítások feltételezik, hogy a sejtek korábbi döntései nem visszafordíthatatlanok, hanem megfordíthatók és megváltoztathatók. Egy ilyen „dinamikus koncepció az identitás megtalálására” azon az elgondoláson alapul, hogy a sejtfenotípus fenntartása folyamatos szabályozást igényel. Elvileg ez azt jelenti, hogy lehetővé kell tenni a differenciált sejtek újraprogramozását, és ezáltal a szövetek és szervek regeneratív tulajdonságainak megerősítését.
Mesenchymális őssejtek kiválasztása és manipulálása myoblastok és kardiomiociták előállítására
A mezenhimális őssejtek (MSC) a különböző szervek stromájában (tartószövetében) fordulnak elő. A csontvelő olyan MSC-ket tartalmaz, amelyek képesek a különféle sejttípusok, köztük a szív- és vázizmok, valamint a neuroektodermális sejtek tulajdonságainak megszerzésére (7. ábra). A genetikailag jelölt csontvelőből származó MSC-k használata lehetővé tette a kutatók számára, hogy betekintést nyerjenek az MSC-k differenciálódási potenciáljába in vivo korai egér embriókba történő injekció után kell bevenni. A specifikus genetikai szelekciós stratégiák és az indukciós protokollok kombinálásával sikerült viszonylag egységes sejtpopulációkat előállítani, amelyek rendelkeznek az izomsejtek jellemzőivel, és szükség esetén terápiás célokra is felhasználhatók.
Ezenkívül a csoport a myoblastok és kardiomiociták előállításához szükséges MSC-k hatékony kiválasztására és bővítésére szolgáló módszerek optimalizálásán dolgozik. Meghatározzák e sejtek terápiás potenciálját is. Ez a megközelítés azonban csak akkor lehet sikeres, ha lehetséges többet megtudni a különböző sejtvonalak meghatározásához és differenciálódásához szükséges jelekről és folyamatokról.
Kutató: Fikru Belema Bedada, Kerstin Broich
Úgy tűnik, hogy a mezenhimális őssejtek identitásukat előnyben részesítik a meglévő váz- és szívizomsejtekkel történő fúzió révén. Ez a következtetés a bemutatott kísérletből származik, amelyben a mesenchymális őssejteket vörös színezékkel jelöltük, és zöld színű izomsejtekkel tenyésztettük egy különböző méretű pórusú membránon keresztül. A mezenhimális őssejtek csak akkor tudták kifejezni az izomfehérjét (narancssárga), ha a szűrő pórusmérete elegendő volt a sejtek szabad áthaladásához. Ha ezt nem garantálják, a mesenchymalis őssejtekben nem találhatók izomfehérjék.
Műholdsejtek: a proliferáció, a sejtciklusból való kilépés és a differenciálódás szabályozása a szövetek regenerálása során
A műholdas sejtek a vázizmok őssejtjei. A miotubusok bazális lapja és plazmamembránja (sarcolemma) között helyezkednek el, ahol testmozgás, izomsérülések vagy izomrostokat károsító betegségek során aktiválódnak. A tudósok elemzik azokat a mechanizmusokat, amelyek az izomszövet regenerációja során szabályozzák a műholdas sejtek szaporodását, a sejtciklusból való kilépést és differenciálódást8. ábra). Az FGF növekedési faktor gének családjában célzott mutációval rendelkező egér mutánsok genetikailag jelölt sejtjeinek átültetésével megmutatták, hogy a myogén őssejtek autokrin-függőek az FGF-ektől. A domináns negatív retrovírusok használata azt sugallja, hogy az FGF-ek rasz- és ral-függő kaszkádot indítanak el, amely elindítja a sejtek migrációját.
A kutatók pre-klinikai modellként meghatározzák a generikus és genetikailag módosított növekedési faktorok potenciálját a transzgénikus állatok vázizom betegségeinek terápiájában és megelőzésében. Kétféle megközelítést alkalmaznak: 1) transzgenikus állatmodellek létrehozása a növekedési faktorok, elsősorban az FGF-ek, a miosztatin és az SF/HGF működésének elemzésére; 2) Géntechnológiával módosított mioztatin-alapú növekedési faktorok kiválasztása módosított biológiai spektrummal. A regenerációs növekedési faktorok elemzését olyan kísérletek támasztják alá, amelyek a sejt-autonóm folyamatok funkcióját vizsgálják a műholdas sejtek aktiválásában és fenntartásában.
Kutatók: Svetlana Oustanina, Michal Mielcarek, Stefan Günther, André Schneider
A Pax7 párosított box gén felelős az izom őssejtkészletének fenntartásáért. A kék szín a Pax7 gén aktivitását mutatja a műholdas sejtekben, amelyek az izolált izomrostokon „műholdas helyzetben” helyezkednek el. A Pax7 egérmutánsokban a műholdsejtek száma csak kissé csökken az egér fiatalkorában (P 11), de az életkor növekedésével gyorsan csökken (P 60). Ezenkívül a Pax7 mutáns műholdas sejtek a CD34 őssejt marker expressziójának elvesztését mutatják.