Enzim-szubsztrát felismerés katalizált fehérje hajtogatási reakciókban

Enzim-szubsztrát felismerés katalizált fehérje-hajtogatási reakciókban Értekezés a doktori fokozat megszerzéséhez doktor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) 1980 Karlsburg Halle-ban (Saale) 2009

Doktori pályázat benyújtása: 2009. október 8-án A tudományos kollokvium napja: 2009. december 21. Recenzens: (1) Prof. Dr. Milton T. Stubbs (2) Prof. Dr. Jochen Balbach (3) PD Dr. Jochen Reinstein

Az igazi tudós hallgatja a természet intelligenciáját és látja a dolgok természetét. Anthony G. E. Blake

Tartalomjegyzék 3.2.3. Összefoglaló vita: a kötőhelyek lokalizálása az SlyD * -ben és a chaperone aktivitás jellemzése. 103 3.3. Az SlyD * peptidil-prolil-izomeráz-funkciója. 105 3.3.1. Az Y68W mutáció jelentősége a prolil-izomeráz SlyD * katalitikus mechanizmusában. 105 3.3.2. Valós idejű NMR vizsgálat az RNáz T1 (S54G/P55N) újratekeredésének katalizálására. 107 3.3.2.1. 3D-NMR-spektroszkópia az RNáz T1 kinetikus hajtogatási köztitermékének meghatározásához (S54G/P55N). 108 3.3.2.2. Egy második konformáció NMR spektroszkópiai felfedezése a natív RNáz T1-ben (S54G/P55N). 111 3.3.2.3. Az újratekeredési katalízis megfigyelése sorozatban rögzített 2D 1 H/15 N-TROSY-HSQC spektrumokkal. 113 3.3.3. Összefoglaló megbeszélés: Az RNáz T1 (S54G/P55N) átmeneti hajtogatási köztitermékének SlyD * katalizált újratekeredésének valós idejű NMR-vizsgálata. 119 4. Összegzés. 121 5. Összegzés. 123 6. Rövidítések listája. 125 7. Irodalomjegyzék. 129 8. Függelék. 143 8.1. Illusztrációk. 143 8.2. Táblázatok. 159 8.3. Pulzus programok. 175 8.4. Felix makrók. 191 9. Saját publikációk. 193 10. önéletrajz. 194 11. Köszönetnyilvánítás. 195 III

A bevezetési hőmérséklet és a katalitikus körülmények optimalizálva vannak. Ezen túlmenően a kérdéshez szükséges a valós idejű NMR módszerek fejlesztése és adaptálása. A jelen munka célja tehát a lassú hajtogatású reakciók PPIázok általi katalizálásának molekuláris megértése, valamint az SlyD * chaperone és PPIase domének közötti domén kommunikáció. 19-én

Anyagok és módszerek dimenziója rögzítve. Az FHSQC spektrum időtartama 4 perc 52 s volt, és a spektrumokat az NMR-titrálásokhoz és a kémiai eltolódás elemzéséhez hasonlóan értékeltük a [2.14] egyenlet alkalmazásával. 59

Az eredmények és a vita megjelölve. A keresztjelek térfogatát használják a fejlesztési átmenet értékelésére. A térfogat csökkenése figyelhető meg az őshonos fajok keresztcsúcsainál, és a térfogat növekedése a denaturált fajok eltérő kémiai eltolódású jelei esetében. Összesen 93 aminosavmaradék értékelhető a natív állapot szempontjából (függelék, 8-1. Táblázat). 3-6. Ábra: Az SlyD * H/15 N TROSY-spektrumai karbamid okozta kibontakozás közben. A SlyD * spektruma natív állapotban 0 M karbamidnál, B kibontott állapotban 5,5 M karbamidnál és C az átmeneti középpontnál 2,2 M karbamidnál. Az átmenetet 50 mm Na 2 HPO 4-ben, 100 mm NaCl-ban, 10% D20-ban, pH 7,5-ben 15 ° C-on és 0,67 mm fehérjekoncentrációban mértük. A hozzárendelt keresztjelek megfelelő átmeneti görbéjét a 3-7. Ábra mutatja. Néhány példa a kétállapotú modell szerinti átmeneti görbét mutató keresztcsúcsokra a 3-7. Maradékok, amelyek keresztcsúcsa 68 volt

Eredmények és megbeszélés A B 3-14. Ábra SlyD * H/D cseréje. A A SlyD * gerinc-amid protonjainak védelmi tényezői logaritmikus ábrán. A téglalapok másodlagos szerkezeti elemeket képviselnek, a kitöltött téglalapok a β-lapokat, a nyitottak az α-hélixeket jelentik. B Magas (S> 10 4, kék) és alacsony védelmi tényezők (10 2 S 10 4, cián) területei az SlyD * szerkezetére. A védelmi tényezőket a [2.26] egyenletnek megfelelően számoltuk. Azokat a területeket, ahol a megfelelő keresztjelek kicserélődtek a kísérlet holt idején belül (40 perc), szürke színnel jelöltük. A nem hozzárendelt maradványok és prolinok fekete színűek. Amid protoncsere a gyors cserereakciók meghatározásához A módosított MEXICO technikával (New MEXICO, 2.7.6.) A cserefolyamatok 10 és 250 ms közötti időablakban határozhatók meg. Azon amid protonok esetében, amelyeknél az oldószeres protonokkal való kicserélés az alacsonyabb védelem miatt nem volt kimutatható H/D cserével, a New MEXICO-val magasabb árfolyamokat elemeztek az említett időablakban. A 3-15D. Ábra az amidprotonok mágnesezettségének újjáépítését mutatja a polarizált vízprotonok cseréjével.

Eredmények és megbeszélés 3-15. Ábra Gyors amid protoncsere (New MEXICO). A-C 1 H/15 N-FHSQC spektrumok az amid protoncsere előtt (referencia) és 60 ms vagy 250 ms a cserereakció megkezdése után. D Cserélje kinetikáját az SlyD * kiválasztott aminosavmaradékaira pH 7,5 és 15 C hőmérsékleten. A kinetika mono-exponenciális függvényhez történő adaptálása 512 ± 5 s -1 (R95), 37 ± 3 s -1 (G86), 14 ± 2 s árfolyamokat eredményezett. -1 (S40) és 12 ± 2 s -1 (Q102). A megadott hibák a mono-exponenciális függvényhez történő adaptációból származnak. A cserereakciók értékelése a termodinamikai stabilitás szempontjából csak akkor végezhető el, ha a cserefolyamat az EX2 mechanizmus szerint halad (2.7.6). Az EX1 vagy EX2 mechanizmushoz való tartozás ph-függősége miatt az új MEXICO kísérletet megismételtük két másik ph értékkel (ph 6.0, ph 9.0). 20 maradék esetében megfigyelhető volt az áttérés az EX1 tartományba, magas pH-érték mellett. Ezeket termodinamikai szempontokból kihagyják. A fennmaradó 27 aminosavmaradék védelmi tényezõit és termodinamikai stabilitását kiszámítottuk a [2.26] egyenlet szerint (függelék, 8-8. Táblázat). 79

7,0 kj/(mol). Az IF domén jelenléte azt jelenti, hogy az SlyD * az izolált FKBP doménhez viszonyítva (SlyD * - IF, G U (H 2 O)

4,7 kj/(m mol)) óriási növekedés a stabilitásban és a megnövekedett kooperativitás. Ez megmagyarázza mindkét terület összehangolt fejlődését is. A SlyD * olyan szövetkezeti hajtogatási egységként bontakozik ki, amelyben a két tartomány egyikét sem lehet lokálisan kibontani, amikor a másik összecsukódik. A natív állapotú hidrogéncsere-elmélet segítségével azt is meg lehet mutatni, hogy az FKBP egységként bontakozik ki az IF-doménnel, mivel részlegesen hajtogatott köztes állapotokat vagy összecsukható alegységeket nem lehet kimutatni. Ni 2+ jelenlétében az SlyD jelentős termodinamikai stabilizációja tapasztalható (1-155). Összehasonlítva a TtSlyD kristályszerkezetével (Löw et al., 2009), a fémion kötődési helye lokalizálható volt. Az FKBP domén utolsó α-spiráljában (α3) található egy hisztidin motívumban: His149-Gly150-His151-Val152-His153 az E.c.SlyD-ben vagy His145-Gly146-His147-Ala148-His149 a TtSlyD-ben. Ez az utolsó α-spirál egyedülálló az FK506-kötő fehérjék között, és csak az SKD-vel homológ FKBP-kben fordul elő. Így nemcsak új strukturális, hanem új funkcionális elemet is képvisel

Rövidítések listája 6. Az 1D, 2D, 3D, egy-, két-, háromdimenziós rövidítések listája A 280 nm AcCN Amp A.U. más néven bp BEST BSA vagy c CD CsA C p 5 MW G u (H 2 O) H u (T m) S u (H 2 O) n d [D] [D] 1/2 ddh2o DNS DTT dyt ε E A E.c. (E. coli) EDTA ESI FID FKBP abszorpció 280 nm-en acetonitril ampicillin abszorpciós egységek önkényes egységek bázispár (DNS) sávszelektív gerjesztés rövid-átmeneti szarvasmarha szérum albumin (szarvasmarha szérum albumin) vagy koncentráció körkörös dikroizmus Ciklosporin A hőkapacitás változása (izobár folyamat) átlagos változás kémiai eltolódás nélküli stabilizáló entalpia denaturáló van hiányában van H Hoff-entalpia változás az entrópiában a fénytörési indexek kibontakozása során a küvetta rétegvastagsága (dm-ben) denaturáns-indukált kibontakozó kétszeresen ioncserélt vízben (maradék vezetőképesség 0,055µSithiothreitolsav (közepes triptoneukleinsav) ) moláris extinkciós együttható aktivációs energia Escherichia coli etilén-diamin-tetraacetát elektrospray ionizáció nélküli indukciós bomlás FK505 kötő fehérje 125

Rövidítések listája FT GdmCl HCl HMQC hnoe HSQC Hz (MHz, GHz) IF INEPT IPTG ITC k 0 k cat k cat/KM k ch k cl KDK eq k int k kat KK KM k op N n NaOH NMR NOE NOESY M m (Új) MEXICO perc min. Furier transzformáció guanidinium-klorid sósav heteronukleáris többszörös kvantum koherencia heteronukleáris NOE hatás heteronukleáris egyetlen kvantum koherencia Hertz (s -1) (megahertz, gigahertz) insz-in-flap érzéketlen magok fokozása polarizációs transzfer izopropil-β-Dop-thiog A katalizálatlan újracsomagolási reakció sebessége Forgalmi sebesség Egy enzim katalitikus hatékonysága Kémiai átváltási sebesség Zárási sebesség Diszociációs állandó Egyensúlyi állandó Belső cserearány (meghatározva a modellpeptidekre) A katalizált újratekerési reakció sebessége Hidrofób peptid a HiPIP szignálpeptid szekvenciából két lizinnel, arginin helyett Michaelis-Menten nátrium állandó nyitási sebesség Mágneses R esonancia Nuclear Overhauser Enhancement Nuclear Overhauser Enhancement spektroszkópia Moláris (mol/l) Gyors protoncserék kooperativitási paramétereinek mérése izotóppal jelölt vegyületekben Minimum legalább 126 perc

Rövidítések listája MS Ni-IMAC OD P PCR PPIase ppm RCM-T1 RCM-α-La RNase T1 RR s SDS-PAGE SlyD SlyD * SOFAST SUMO T m Tat Tat27 TEMED TFA TFE TOCSY TPPI (Bis-) Tris TROSY U uu. UV VRR (v/v) WATERGATE WHP tömegspektrometria Ni-ion fém affinitáskromatográfia optikai sűrűség védelmi faktor polimeráz láncreakció peptidil-prolil-cisz/transz-izomeráz egymillió rész redukált és karboximetilezett RNáz T1 redukált és karboximetilezett α-laktalbumin ribonukleáz T1 hidrofób peptid Szignálpeptid-szekvencia második Nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gél elektroforézis érzékenység a lízisre D EcSlyD (1-165) sávszelektív optimalizált flip-angle rövid-tranziens kicsi ubiquitin-szerű módosító hőmérséklet az átmeneti központban iker-arginin transzlokon szignál peptid szekvencia CueO N, N, N, N -Tetrametil-diamin-trifluor-ecetsav Trifluor-etanol teljes korrelációs spektroszkópia időarányos fázisnövekedés Tris- (hidroxi-metil) -amino-metán keresztirányú relaxációra optimalizált spektroszkópia kibontakozott állapotban, többek között percenkénti fordulatok mellett, bizonyos körülmények között ultraibolya hidrofil peptid a HiPIP szignálpeptid szekvencia térfogatában térfogat Az elnyomás gradiensen alapuló gerjesztéssel csodálatos hisztidinben gazdag fehérje 127

Rövidítések listája (w/v) YpSlyD pl. Térfogat/tömeg A Yersinia pestis SlyD-jét, például az aminosavakat a szokásos egy- vagy hárombetűs kódokkal rövidítettük. 128

8. függelék 8.1. Ábrák: 5-1 µm SlyD * fluoreszcencia emissziós spektruma 50 mm Na 2 HPO 4-ben, 100 mm NaCl, pH 7,5 15 C-on. A gerjesztés 278 nm-en történt. A folytonos vonal a natív állapotot, a kibontott állapot görbéjét ábrázolja. A fehérje szaggatott vonalakkal jelenik meg. 8-2. Ábra: Az SlyD * -F84W karbamid okozta kibontakozó átmenete. Az átmenet detektálása 308 nm-en 280 nm-es gerjesztés után (háromszögek), detektálás 344 nm-en 295 nm-es gerjesztés után (körök). A folytonos vonalak az adatok adaptációját jelentik a kétállapotú modellhez, és az így kapott stabilitási paraméterek a következők: (280 nm-es gerjesztés után): GU (H 2 O) = 16,8 ± 0,7 kj/mol, m eq = 6,8 ± 0,3 kj/(mol), [D] 1/2 = 2,5 M. A második átmenet, amelyet B-ben nagyítottunk, nem értékelhető. A folytonos vonal csak a könnyebb megtekintés érdekében. Az átmenetet 50 mm Na 2 HPO 4-ben, 100 mm NaCl-ban (pH 7,5) mértük 15 ° C-on. A fehérjekoncentráció 5 µm volt. 143

Függelék 8-3. Ábra Karbamid által kiváltott fejlesztési átmenet SlyD * - IF-ből. Kibontakozó átmenet a SlyD * (nyitott szimbólumok) és a SlyD * - IF (zárt szimbólumok) felől. A folytonos vonalak az adatok adaptációját jelentik a kétállapotú modellhez, az így kapott stabilitási paraméterek az SlyD * -re vonatkoznak: GU (H 2 O) = 18,4 ± 0,6 kj/mol, m eq = 6,9 ± 0,2 kj/(m mol), [D] 1/2 = 2,7 M és SlyD * esetén: IF: GU (H20) = 13,9 ± 0,5 kj/mol, m ekvivalens = 3,2 ± 0, 1 kj/(m mol), [D] 1/2 = 4,3 M Az átmeneteket 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, pH 7,5, 15 ° C hőmérsékleten mértük. A fehérjekoncentráció 5 µm volt. 8-4. Ábra két Ni 2+ -val rendelkező homológ SlyD izoterm titrálási kalorimetriai adatai. Az integrált hőmennyiséget a ligandum/fehérje koncentrációarányhoz viszonyítva ábrázoltuk. Mindkét esetben két kötési esemény látható, de az összekapcsolt folyamatok miatt az adatok megfelelő kötési modellhez való adaptálása nem volt lehetséges. 18 µm TtSlyD-His 6 izoterm titrálása 270 µm NiCl2-vel (10 mm-es Tris-ben, pH 25 C 7,5, 25 C). B 16 µm E.c.SlyD (1-165) -His 6 izoterm titrálása 240 µm NiCl2-vel. 144

Függelék 8-5. Ábra: A TtSlyD izoterm titrálásának kalorimetriai görbéi Co 2+, Gd 3+ és Zn 2+ -val. A felső ábra azt a villamos energiát mutatja, amelyet a megfelelő fémion minden egyes injektálása után észleltek. Az alábbi ábrán az integrált hőmennyiségeket ábrázoljuk a fémion/TtSlyD koncentráció arányhoz viszonyítva. A termodinamikai paramétereket a kísérleti adatokhoz való nemlineáris illesztésből kaptuk meg egy kötési hellyel rendelkező kötési modellen. A 27 um TtSlyD izoterm titrálása 270 µm CoCl 2-val (10 mm-es Tris-ben, pH 25 C 7,5, 25 C). A kötéssel felszabaduló reakció entalpia -13,2 ± 0,2 kcal/mol volt; az affinitás konstans 2,4 ± 0,2 x 106 M -1 volt. Ennek eredményeként a KD értéke 420 nm volt, a pirossal jelzett adatok megfelelnek a TtSlyD GdCl3-mal történő titrálásának. B 27 µm TtSlyD izoterm titrálása 270 µm ZnCl 2-val (10 mm-es Tris-ben, pH 25 C 7,5, 25 C). A kötéssel felszabaduló reakció entalpiája itt -10,0 ± 0,1 kcal/mol volt; az affinitás konstans 9,8 ± 1,5 x 106 M-1 volt. A kapott KD-érték 102 nm volt, 145

Függelék 8-6. Ábra: 15 N-SlyD * NMR-titrálása natív RNáz T1-gyel (S54G/P55N) 50 mm Na 2 HPO 4-ben, 100 mm NaCl-ban, pH 7,5 25 C-on. Egyes keresztcsúcsok kémiai eltolódásának változása a strukturálatlan C-terminális rész és az His 6 tag nem specifikus kölcsönhatásairól. 8-7. Ábra: A Tat27 fluoreszcenciával detektált titrálása SlyD * -vel 50 mm Na 2 HPO 4-ben, 100 mm NaCl-ban, pH 7,5 25 C-on. A folytonos vonal megfelel egy kötési hellyel rendelkező egyszerű kötési modellhez történő adaptációnak. Az 1 sztöchiometria 0,5 ± 0,1 µm disszociációs állandót eredményez. A Tat-peptid aminosav-szekvenciája: QRRDFLKYSVALGVASALPLWSRAVFA. 146

Függelék 8-8. Ábra 15 N-SlyD * titrálása RCM-T1-vel. A kémiai eltolódás változásának függése az RCM-T1 és SlyD * (A) koncentrációarányától és az RCM-T1 (B) szubsztrátkoncentrációtól a D88 és S26 két amid protonján az NMR-titrálástól. A Az egyensúlyi kötési görbét a lineáris illesztésből kapjuk. Az ekvivalencia pont 1 körül van, és 1: 1 komplexet jelöl. B A folytonos vonalak csak a szem irányítására szolgálnak, de nincs fizikai jelentésük. C Az RCM-T1 fluoreszcenciával detektált titrálása SlyD * -vel. A folytonos vonal megfelel egy kötési ponttal rendelkező egyszerű kötési modellhez történő adaptációnak. Az 1-es sztöchiometria 4,4 ± 0,8 µm disszociációs állandót eredményez. Mindkét titrálást 50 mm Na 2 HPO 4-ben, 100 mm NaCl-ban (pH 7,5) 25 ° C-on végeztük. 147

Függelék 8-9. Ábra: Az izolált IF domén H/15 N-FHSQC spektruma 0,5 M (NH 4) 2S04 jelenlétében 25 C-on. A kibontott fajok keresztcsúcsai főleg a Spektrum 7,8-8,4 ppm mellett. A strukturált fajok diszperziós jelének intenzitása körülbelül 30%. 8-10. Ábra 450 µm inzulin 1D 1 H spektrumának szekvenciája az aggregációs reakció megkezdése után 25 ° C-on DTT hozzáadásával. Megmutatjuk az A-lánc amidprotonjaitól származó, kis jelű területet. 148

Függelék 8-13. Ábra 1 H/15 N-heteronukleáris NOE 14,2 T és 25 C hőmérsékleten SlyD * (fekete) és SlyD * -Y68W (piros) esetén. A két domén eltérő dinamikája a két fehérjében jól látható a picobis nanoszekundumos NMR időskálán, az IF domén sokkal rugalmasabb, mint az FKBP domén. W68 környékén a mutáns fokozott dinamikát mutat. A hnoék adatait Michael Kovermann szívesen bocsátotta rendelkezésre. 8-14. Ábra Az SlyD * termodinamikai stabilitása a GdmCl-rel szemben. GdmCl-indukálta SlyD * fejlődési átmenet 10 mm-es Tris-ben, ph 20 C 7,5 20 C-on (A) és 10 mm-es Bis-Tris-ben, ph 10 C 6,0 10 C-on (B). A folytonos vonalak az adatok adaptációját képviselik a kétállapotú modellhez a következő stabilitási paraméterekkel: GU (H 2 O) = 15,3 ± 1,4 kj/mol, m ekvivalens = 13,7 ± 1,1 kj/(m mol) és [D] 1/2 = 1,1 M (ph 7,5, A) vagy GU (H20) = 12,0 ± 0,8 kj/mol, m ekvivalens = 13,0 ± 0,6 kj/(m mol) és [D] 1/2 = 0,9 M (ph 6,0, B). A fehérjekoncentráció 2 µm (A) és 5 µm (B) volt. A hibák abból adódnak, hogy az adatokat illesztettük a [2.10] egyenletbe. 150

10. függelék 9 8 7 6 5 1 H (ppm) 8-15. Ábra Az SlyD * H spektrumai 10 mm Tris-ben, ph 20 C 7,5 GdmCl jelenlétében. Az alacsony felbontás és a jelintenzitás GdmCl (0,4 M GdmCl (vörös spektrum) és GdmCl (kék spektrum) nélkül) jelenlétében jól látható. 151

Függelék 8-16. Ábra halmozott ábra az RNase T1 (S54G/P55N) újratekercseléséhez. 1,9 mm RNáz T1 (S54G/P55N) 1D 1H spektrumának szekvenciája 190 µm SlyD * (B) távollétében. Az alacsony mezõs tartomány az amid proton régióval látható. A spektrumonkénti időbeli felbontás 5 perc 21 másodperc volt, mivel négy egymást követő spektrumot átlagoltunk a jel/zaj arány javítása érdekében. 152

Enzim-szubsztrát felismerés katalizált fehérje hajtogatási reakciókban - PDF ingyenes letöltés