G-quadruplex DNS-affinitás megközelítés enzimatikusan aktív G4 reszolváz1 tisztításához

Összegzés

A G4 Resolvase1 a G-kvadruplex (G4) struktúrákhoz kötődik a legszorosabb affinitással egy G4-kötő fehérjéhez, és a HeLa-sejtekben a G4-DNS letekercselő aktivitásának többségét adja. Leírunk egy új protokollt, amely kihasználja a G4-Resolvase1 affinitását és ATP-függő letekercselő aktivitását a katalitikusan aktív rekombináns G4R1 specifikus tisztítására.

Absztrakt

Bevezetés

Itt bemutatunk egy új expressziós és tisztító rendszert (1.ábra) amely kihasználja az rG4R1 ATP-függő G4-feloldó aktivitását, hogy hatékonyan izolálja az aktív enzimet. Ez a rendszer adaptálható más olyan ATP-függő nukleinsav enzimek tisztítására, amelyeknél az enzimatikus reakció terméke inkább a szubsztrát a megkötéshez, mint a G4R1 esetében.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Az rG4R1 tisztításához felhasználható G4-DNS-szerkezetek előkészítése (biotinilezett G4-DNS G-quadruplex képződése)

  1. Rendelje meg a következő Z33-Bio nevű DNS-oligomert 1 µmol skálán: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3'. Győződjön meg arról, hogy a biotin-rész az oligomer 3'-végén van.
  2. Készítsen elő egy 10x G4 puffert: 450 mM Tris-HCl, pH 8, 25 mM EDTA és 2500 mM NaCl.
  3. Szuszpendáljuk újra a Z33 oligomert 250 ul vízben (úgy, hogy az oligomer koncentráció körülbelül 2,5 mM legyen). Adjunk hozzá 25 µl 10x G4 puffert és keverjük össze. Inkubálja az oligomert 50 ° C-on

48 óra. Röviden centrifugáljuk a csövet a kondenzáció összegyűjtésére (

1000 xg, 10 s). Hozzáadás

2. G4-DNS struktúrák előállítása az rG4R1 enzimaktivitás vizsgálatához (TAMRA-jelzett G4-DNS képződése)

  1. Rendelje meg a következő DNS-oligomert, az úgynevezett Z33-TAM-ot 1 µmol skálán: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Győződjön meg arról, hogy a TAMRA rész az 5. oligomer végén van.
  2. Kövesse az 1. szakaszban leírt eljárást a G-quadruplex képződéséhez, azzal a különbséggel, hogy az ultraibolya (UV) árnyékolás nem szükséges, mert a G-quadruplexszel jelölt tetrametil-rodamin (TAMRA) meztelenül a szem számára könnyen látható lesz. Ismét ügyeljen arra, hogy a gélen szerepeljen fakulásszabályozás.
  3. A TAMRA-jelölt G-quadruplex DNS spektrofotométer-leolvasásának elvégzése után, az 1. lépésben leírtak szerint hígítsuk a kialakult G-quadruplex-et 0,2 pmol/µl-re TNE pufferrel. Végül adjunk hozzá glicerint 10% végkoncentrációig, és -20 ° C-on tároljuk.

3. Transzformálja (DE3) kompetens pLysS-et PTRiEx4-DHX36-tal (humán G4R1-et kódoló plazmid), és növesztse/indukálja nagy baktériumkultúrákat

225 fordulat/perc. Növelje a tenyészeteket, amíg az OD 600 értéke kb. 0,4-0,6, ami általában 4-6 órát vesz igénybe, a kezdeti sejtsűrűségtől függően.
JEGYZET: Ehhez periodikus sűrűség-monitorozásra van szükség spektrofotometriás leolvasásokkal, és elengedhetetlen, hogy a tenyészetek ne növekedjenek jóval 0,5 OD fölé. Centrifugáljuk 1 ml baktériumot, és a derített levest használjuk elnyomó oldatként mint spektrofotometrikus leolvasást.

  • A megfelelő OD 600 elérése után azonnal helyezze a tenyészeteket jégre, majd gyorsan lehűtse 10 ° C-ra. 70% EtOH-val tisztított hőmérővel monitorozza a hőmérsékletet. Gyorsítsa fel a hűtést az injekciós üvegek gyors forgatásával jég közben, ami korlátozza a baktériumok szaporodását a rekombináns fehérjék indukálása előtt.
  • Adja hozzá az IPTG-t az mM 1 végső koncentrációhoz (

    4. Az emberi rG4R1 tisztítása

    18 000 xg) mikrocentrifugában 4 ° C-on (

    200 µl tisztított EB, amely rG4R1-et tartalmaz. Tegyen félre két 7 alikvotot (a megfelelő dátummal megjelölt PCR-csövekben) a minőség-ellenőrző enzimaktivitás vizsgálatban történő felhasználás céljából, amely teszteli, hogy a rendkívül aktív rG4R1 valóban megtisztult-e.

  • A tisztított rG4R1-et -80 ° C-on az aktivitás vizsgálatáig tároljuk.

    • 5. Az rG4R1 tisztított enzimatikus aktivitás vizsgálatának minőség-ellenőrzése

    6. Magasan aktív rG4R1 előkészítők, alikvotálás és tárolás egyesítése

    JEGYZET: Ehhez a lépéshez 2 emberre van szükség. Azon downstream vizsgálatok száma és enzimigénye, amelyekben a tisztított rG4R1-et fogják használni, meghatározza, hogy hány készítményre van szükség az alikvotálás előtt. Egy tipikus készítmény 8 nagyon aktív készítmény összevonásából áll (így összesen 16 500 ml indukált baktériumtenyészetet használnak), de ez a szám tetszőleges és laboratóriumi specifikus.