Gyors alkalmazkodás az élelmiszer-hozzáférhetőséghez a dopamin által közvetített morfogenetikus válasz révén
alanyok
absztrakt
bevezetés
A ragadozó-zsákmány kölcsönhatások fejlődési és morfológiai válaszokhoz vezethetnek, amelyek jelentős ökológiai és evolúciós hatásokkal járnak 1, 2, 3, 4, 5. A ragadozók által kiváltott védekezések csökkentik a zsákmány fogyasztásának kockázatát, míg a ragadozók által kiváltott bűncselekmények javítják az 1., 2., 3., 6., 7., 8. ragadozó fogyasztását vagy versenyképességét. Ezek a fenotípusos változások tehát befolyásolhatják a trofikus kölcsönhatásokat, a ragadozó és a zsákmány populációk dinamikáját, valamint a közösség dinamikáját, és elősegíthetik az 1., 2., 6. speciációt. Ezen reakciók mechanisztikus megértése szükséges evolúciójuk, korlátaik, adaptív értékük és funkcionális következményeik megértéséhez. 12. .
Annak érdekében, hogy meg lehessen különböztetni, hogy a hosszú karok alacsony élelmiszer-sűrűséggel indukálódnak-e, vagy fordítva, hogy a rövid karok nagy élelmiszer-sűrűséggel indukálódnak-e, meg kell határozni az ételre adott reakció mögöttes mechanizmusát. A táplálkozás előtti Strongylocentrotus purpuratus lárvák esetében ez a fejlődési reakció néhány napon belül bekövetkezik, és az algák közvetlen kemoszenzációját igényli 15; Ezért valószínűleg neuroszenzoros mechanizmuson keresztül következik be. Beszámolunk arról, hogy a dopamin az a neurológiai út, amelyen keresztül az algaszenzáció megváltoztatja a fejlődést. A dopamin jelátvitel elősegíti a lárva karhosszának rövidülését egy fejlődési maximumtól. Ezért váratlanul ez a zsákmány által kiváltott plaszticitás nem sértő válasz az erőforrás-beszerzés javítására. A dopamin jelek és a kar hosszának kísérleti manipulálásával értékeljük ennek a fenotípusos válasznak a költségeit, előnyeit és korlátait, és bizonyítékot szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy a tengeri sün lárvák széles körben alkalmazott táplálkozási utat választhattak a fejlődési válaszokhoz.
Eredmények
Az algák által kiváltott dopamin szignál gátolja a kar meghosszabbítását
Differenciális interferencia kontrasztképek a lárvákról az etetés előtti időszak végén, az 5. napon, anélkül tenyésztve ( a ) és ( ) Algák, a gasztrula stádiumában kezdődnek. A csontvázelemek lenyelés utáni hosszát és a testet fekete vonalak jelzik. Mennyiségének meghatározása c ) posztorális karhossz, amely 20,2% (± 3,9%) változást jelent, és ( d A testrúd hossza, amely 3,9% (± 1,5%) változást jelent azoknál a lárváknál, amelyeket (zöld, n = 20) és (kék, n = 18) algákkal tenyésztettek. Diák kétoldalas t-teszt, *** P
( a ) Változás a posztorális kar és a testrúd hosszában 5 napos lárvákban, amelyeket DRD2 agonista quinpirollal kezeltünk a megadott koncentrációban a kontrollhoz képest. Eldobható ANOVA posztorális karhosszra, F 3,463 = 30,586, P
( a ) Változás a posztorális kar és a testrúd hosszában azoknál a 4 napos lárváknál, amelyeket algával vagy anélkül tenyésztettek kontrollként (kék) és transzlációs blokkoló MASO-val 0,4 mM (TH MASO1, világosszürke) kezeléseknél. ANOVA (S2 kiegészítő táblázat), Kezelés × Algák a posztorális fegyvereknél, F 1.286 = 19, 604, P 18 (Kiegészítő S2. Ábra), és kiterjeszti azokat a folyamatokat a csillószalag hossza mentén (4e. Ábra), amelyek részt vehetnek az algaszenzációban. Ezek az adatok egyetértenek a dopamin-pozitív sejtek eloszlásával a S. droebachiensis lárvákban 19 és neuroszenzoros funkcióval. A dopamin és a PMC marker miatt kétszer festett embriók nagyobb nagyítása (× 40) azt mutatta, hogy a dopamin pozitív sejtek közvetlenül szomszédosak voltak a PMC-kkel (4g-j). Noha a másodlagos endokrin jel 9 gyakran neurostimulálódik a plasztikus fenotípusos válaszokban, a dopamin-pozitív sejtek PMC-khez való közelsége és a posztorális karokban lévő fedő ektoderma megnöveli annak lehetőségét, hogy a dopamin közvetlenül az egyik vagy mindkét sejttípushoz jelezze a kar növekedésének gátlását.
A sebességet korlátozó dopamin bioszintézis TH enzim és egy PMC marker (SM30) fluoreszcens immunohisztokémiai kimutatása referenciaként, 54 órával a megtermékenyítés után (hpf) ( a ) és 60 hpf ( ). Az ezen és a következő mezőkben található fehér nyilak a postorális kar hegyét jelzik. ( c ) Postorális karhossz a hpf-hez képest, amely a kar meghosszabbításának egyidejű kezdetét és a TH-pozitív sejtek első észlelését mutatja (fekete nyíl). A szürke szaggatott vonal jelzi a kezdeti triradiátus hozzávetőleges hosszát. Hiba bar ± sem A dopamin fluoreszcens immunhisztokémiai kimutatása ( d ) és TH ( e ) és PMC markerek, Msp130 ( d ) és az SM30 ( e ), a plute szakaszban (92 hpf). Fluoreszcens in situ teljes hibridizáció a ddc mRNS kimutatására ( f ) a kar posztorális hegyében és a szerotonerg ganglionokban (a képen fent) a korai pluteuson (72 hpf, szóbeli nézet). ( g - j ) Dopamin és PMC (Msp130) immunfoltok nagyobb nagyítású képei a kar hegyén. DAPI-val (kék) festett magok. DA, dopamin DC, dopa dekarboxiláz. Méretjelző sáv ( a - f ) 50 μm, ( g - j ) 10 μm.
Kísérletek a jelek útjának két független pontját megcélzó gének (3. ábra) és a gyógyszerek megszakításával (2. ábra és 3. ábra), valamint a dopamin és a dopamin bioszintetikus enzimek időbeli és térbeli expressziós mintázataival (4. ábra). azonosítsa a dopamint, mint kulcsfontosságú jelet, amely közvetíti az élelmiszerek rendelkezésre állására adott fenotípusos választ. Dopaminjel nélkül karnyújtásnyira elvész a plaszticitás. Így a fenotípusos plaszticitás iránya egyértelmű: A rövid karok nagy ételsűrűségben indukálódnak, amikor a dopamin szignálok gátolják a csontváz nyújtását és így elősegítik a strukturális növekedést.
Az anyalipidek bevitelének és tárolásának következményei
Megmutatva, hogy a dopamin szignalizáció bevonása az élelmiszer-karok méretének csökkentésére irányul, mesterségesen manipulálni tudtuk az élelmiszer-szerkezet méretét az alkalmazkodóképesség meghatározásához. Kipróbáltuk a gyógyszerészetileg változó adagolóeszköz-méretek funkcionális következményeit az etetés és az energiafogyasztás szempontjából. Ez a módszer előnyös volt a változó algakoncentrációkkal szemben, mivel a tengeri sün lárvák tartalmazhatnak exogénen oldott szerves anyagot 20, 21, amely megváltoztathatja anyagcsere-állapotukat, még akkor is, ha még nem etetik őket.
Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az etetőberendezés mérete jól korrelál az élelmiszer-clearance maximális sebességével a 13., 22. fejlődési idő alatt és az Echinoderm lárvák különböző 23. fajai között. A fajok vagy a fejlődési stádiumok közötti méretbeli különbségek (pl. 4 karos vagy 8 karos Echinoplutei) nagyobbak, mint ahogy azt itt egyetlen fejlődési szakaszban, egyetlen fajnál megfigyeltük. Annak eldöntésére, hogy az etetési szerkezet viszonylag kis változásai jelentősen befolyásolhatják-e az algák befogási sebességét, gyógyszerészetileg manipuláltuk az etetési szerkezet méretét, majd hagytuk, hogy a lárvák algamimetikumok szuszpenziójával táplálkozzanak. A posztorális karhossz változása szignifikánsan korrelált a P-vel
( a ) A kiürülési sebesség regressziója a posztorális kar hosszán 5 nap után ismételt kísérletekben (körök, háromszögek és gyémántok) 1500 gyöngy/ml koncentrációban. Mindkét változót a megfigyelt maximumokhoz viszonyítva normalizáltuk. Összevont I. modell regresszió, R 2 = 0, 197, β 1 = 0, 866, P 2 = 0, 877, β 1 = 0, 287 ± 0, 14 (95% CI), n = 6. hibasáv ± sem
vita
A tengeri sün lárvák táplálkozási reakcióját, hasonlóan sok zsákmány által kiváltott tulajdonsághoz, sértőnek ítélték, és növelik a ragadozók 2, 15 táplálékát. Ezzel szemben az adataink azt mutatják, hogy az algák kimutatása során a molekuláris mechanizmus valójában csökkenti az etetési szerkezet méretét. Az algák által kiváltott dopamin jelátvitel elnyomja a lárvák előtáplálásakor alkalmazott standard fejlesztési programot, amely rövidebb karokat eredményez alacsonyabb takarmányozási potenciállal.
A fenotípusos plaszticitás fenntartása érdekében a fenotípusos változásoknak maximalizálniuk kell az adott környezetre való alkalmasságot. Megmutatjuk, hogy a hosszú fegyveres fenotípus maximalizálja az alkalmasságot, ha kevés az élelmiszer, azáltal, hogy növeli az élelmiszer-beszerzési potenciált az anyai lipidek rovására. Míg a rövid fegyveres fenotípus maximalizálja az alkalmasságot, ha az étel bőséges, az anyai lipidek megőrzésével a maximális élelmiszer-ellátási potenciál rovására. További kondíciók lehetnek, például a kar hossza és a gyomorméret 26 és/vagy az úszási teljesítmény 27 között, amelyek ehhez a fejlődési reakcióhoz kapcsolódnak.
Az anyai energiaraktárak más célokra való hozzárendelésének lehetősége a látens hatások révén jelentős következményekkel járhat a túlélés és a teljesítmény sikerében az élet több szakaszában. Például azáltal, hogy növelik a fiatalkorúak fejlődéséhez való hozzárendelésüket, a lárvák képesek lesznek lerövidíteni a planktonban ragadozóknak kitett időtartamot, vagy növekedhet a fiatalkorúak 29,30 minősége. Mivel a S. purpuratusnak magas a letelepedés utáni halálozási aránya, ritka, sikeres toborzási eseményekkel 31, 32, a letelepedéskori állapot fontos tényező lehet a bentosus tengeri sün populációinak dinamikáját szabályozó tényező, amelynek közösségi, 33 és 34 szintű következményei vannak. Ahogy a lárvák gyakorisága vagy súlyossága növekszik, és az élelmiszer-hozzáférhetőség növekszik, az alga gyakoriságának csökkenése az etetés előtti szakaszban a hosszú fegyveres lárvák gyakoribb előfordulásához és a rövid fegyveres lárvák bármely előnyének elvesztéséhez vezet, mint például az anyai energiatárolók átcsoportosítása.
Adataink azt mutatják, hogy a dopamin szignálok alkalmazkodóan alkalmazzák a takarmányszerkezetek fejlődésének gyors megváltoztatását az élelmiszerekre való tekintettel. Csak a mechanikus megértés révén lehet ezt a zsákmány által kiváltott formaváltást a megfelelő ökológiai és evolúciós kontextusba helyezni. Különböző organizmusok, a férgektől az emberekig, a 35-ös, 36-os dopamin jelátvitelét használják a D 2 típusú dopamin receptorokon keresztül, különösen a 37, 38-at az élelmiszer-fogyasztás előrejelzésére. A C. elegans 35, 38, rovarok 39, 40, felnőtt tengeri sünök 41 és emlősök, köztük emberek 36 esetében a dopamin szignál megváltoztatja a viselkedést a lenyelésre számítva, míg a tengeri sün lárvái lenyelés előtt megváltoztatják fejlődésüket és alakjukat. Ezért a lárvák fejlődésének szabályozásában szerepet játszó dopamin-jelátvitel jelenthet választási lehetőséget vagy elmozdulást a dopamin-jelátvitel fokozottan konzervált használatától a táplálék-várakozás közvetítésében.
Mód
Embrió- és lárvakultúra
A Cultured Abalone és a Point Loma Marine Gerinctelenek Laboratóriumának (CalTech) felnőtt tengeri sünjeit, a Strongylocentrotus purpuratus-t 10 ° C-on tartottuk tengervízben. A ivarsejteket 0,55 M KCl intracoelomikus injekcióval gyűjtöttük be. Az embriókat standard módszerekkel tenyésztettük 1-5 embrió/ml sűrűségben, mesterséges tengervízben (ASW) 15 ° C-on algával vagy anélkül (5000 sejt/ml Dunaliella sp.) .
A csontváz hosszának számszerűsítése
A posztorális kar és a testrúd hosszát (mindegyik n ≥ 20) egy véletlenszerű mintából határoztuk meg, amelyet közvetlenül az etetés megkezdése előtt vettünk 5 napos pf-vel, kivéve azokat az embriókat, amelyekbe morfolinót injektáltak, és amelyeket 4 napos pf után vettek, annak biztosítása érdekében, hogy a TH fehérje szintézisének morfolino lebontása még mindig hatékony legyen. A csontvázelemek azonos síkba helyezéséhez a lárvákat mikroszkóp tárgylemezekre préselték, majd egy fordított Zeiss Axiovert 200 M mikroszkóppal 20 × 20-ban képeltük le őket különbözõ következtetési kontraszt alatt, ezáltal a kettõs törésû csontvázelemek könnyen azonosíthatók. A csontváz hosszát a digitális képekről az AxioVision szoftverrel (Carl Zeiss MicroImaging) számszerűsítettük. Bizonyos esetekben (42, amizulprid, egy nagyon szelektív D 2/D 3 dopamin receptor antagonista 43 és α-metil-DL-tirozin-metil-észter-hidroklorid, szelektív inhibitor, amelyet a TH 44 zavar, közvetlenül a táptalaj hígításával (ASW) teljes testvérlárváknak adják be a késői gastrula stádiumban (48-52 hpf), hacsak a szöveg másképp nem rendelkezik, A gyógyszerészeti kísérleteket két nő-férfi párral párhuzamosan hajtották végre.
Mikroinjekciók
A megtermékenyített tojásokat 20% glicerint és morfolinok nélküli rodamin-dextránt (glicerin kontroll) tartalmazó 0,4 mM TH MASO1 vagy 0,15 mM TH MASO2 tartalmú szűrt oldatokkal pótoltuk Eppendorf Femtojet-Injectman NI2 mikromanipulátorral. Leica invertált fluoreszcens mikroszkópot csatlakoztattunk, mikroinjektáltuk (45. hivatkozás). A TH MASO1 injekciókat két különböző nő-férfi párral replikálták. A glicerint és a be nem injektált embriókat összehasonlítottuk, és nem tapasztaltunk szignifikáns változást a csontváz hosszában, a TH immunfestésében vagy az algákra adott válaszban. Néhány későbbi kísérlet ezért nem injektált embriókat használt kontrollként. A transzlációt blokkoló TH MASO1 kifejlesztése az előrejelzett TH (GLEAN 00836) 5'UTR alapján történt, amelyet a RACE megerősített. TH MASO1: 5'-GCGTCCTGCTGTAGAAGATACTTGA-3 '. A TH MASO2 megcélozta az intron 8/exon 9 határát, hogy megbontja a 46-os enzim katalitikus doménjét. TH MASO2: 5'-GCCTACGATGAACAAGAACAAATGT-3 '.
A dopamin-rendellenességek statisztikai elemzése
A posztorális karhossz dózis-válaszát a kinpirollal végzett kezelésre egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltük, amelyet Bonferroni-korrigált páros összehasonlítás követett a kontrollal, hogy meghatározzuk, hogy a változás szignifikáns-e a kontrollhoz képest. Az algákra adott választ gyógyszer- és TH MASO1-rendellenességekben háromutas ANOVA-val értékelték, amelyben rendellenesség-kezelést, algakezelést (algákkal szemben) és kísérleti replikációt határoztak meg, és az átlagos négyzethibát jelölték az f-arány 47 . Mivel minden kísérlet szignifikáns (P> 0,05) interakciót mutatott a rendellenesség és az algák kezelése között a posztorális kar hosszában, ezt követően Bonferroni-korrigált páronkénti összehasonlításokat végeztünk annak megállapítására, hogy az algák által kiváltott változás szignifikáns-e. A TH MASO2-et nem replikálták, és így a Student kétfarkú t-tesztjeivel értékelték. Az összes statisztikai értékelést a SYSTAT v10-ben végeztük három tizedesjegyig terjedő kimenettel, ezért a pontos P értékeket P> 0,001 esetén adtuk meg.
Immunfestés és fluoreszcencia in situ hibridizáció
Etetési kísérlet
Három nőstény féltestvérű lárváját ASW (kontroll), DRD2 agonistával (quinpirol) és DRD2 antagonistával (amisulprid) kezeltük az etető struktúrák mérettartományának maximalizálása érdekében. Ezen kezelések mindegyikéből származó lárvákat három ismételt tenyészetben egyesítettük, 4 órán át ASW-be vittük át, majd az imitációs algák finoman felkevert szuszpenziójával, 10 µm-rel kezeltük. m BSA-val bevont Polybead mikrogömbök (Polysciences, Inc.) 1500 vagy 4000 sebességgel, gyöngyök adagolása ml-enként, 45 percig. A felszedett gyöngyök számát és a csontváz hosszát minden replikációból legalább 30 lárvának mértük, a fentiek szerint. Nem volt szignifikáns különbség az 1 500 gyöngy/ml-rel táplált ismétlődő minták között (kétfaktoros ANOVA, kétfarkú P = 0,950, SYSTAT v.10), ezért a replikátumokat összegyűjtöttük és az I. modell regressziójával elemeztük.
Lipid elemzések
Ismétlődő tenyészetet, mindegyik három nőstény féltestvéréből áll, 500 ml-es főzőpoharakban óvatosan, 15 ° C-on inkubátorban tenyésztjük. A karnyújtás elején (
A normalizált átlagos posztorális karhossz és a triglicerid értékeket a Model II Geometric Mean Regression 52 alkalmazásával értékeltük, hogy figyelembe vegyük a mindkét változóval kapcsolatos hibát. A posztorális karhossz maximálisan normalizálódott. A triglicerid koncentrációt a megtermékenyített petesejtek kezdeti koncentrációjához normalizáltuk (0. nap, a hasítás előtt). A replikátum tenyészeten belüli kezelések azonos kezdeti triglicerid-koncentrációval rendelkeztek, lehetővé téve a kezelések közvetlen összehasonlítását. Mivel nem volt interakció a tenyészetekkel (kétfaktoros ANOVA, kétoldalas P = 0,478, SYSTAT v.10), a két tenyészetet regresszió céljából egyesítettük.
További információ
PDF fájlok
További információ
Kiegészítő ábrák S1-S4 és kiegészítő táblák S1-S3
Megjegyzések
Megjegyzés benyújtásával elfogadja a felhasználási feltételeket és a közösségi irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.