Humán monoklonális antitestek kolorektális elleni immunhisztokémiai és sejtbiológiai elemzése

A Würzburgi Egyetem Kórtani Intézetéből: Dr. professzor med. H.K. Müller-Hermelink Humán monoklonális antitestek kolorektális karcinóma immunhisztokémiai és sejtbiológiai elemzése Nyitó disszertáció doktori cím megszerzéséhez a Würzburgi Bajor Julius Maximilians Egyetem Orvostudományi Karán, Judith Lorenz, Fulda Würzburg, 2004. június

antitestek

Előadó: Dr. professzor rer. nat. Dr. med. H.P. Vollmer játékvezető társ: professzor Dr. med. H.K. Müller-Hermelink Dean: professzor Dr. med. S. Silbernagl A szóbeli vizsga napja: 2005. január 21. A doktorjelölt orvos

a szüleim, Ulrich és Christian

Tartalom 1 Bevezetés 1 1.1 Kolorektális karcinóma 1 1.2 Monoklonális antitestek 6 1.3 A munka célja 11 2 Anyag és módszerek 12 2.1 Anyag 12 2.1.1 Pufferek, oldatok és közegek 12 2.1.2 Vegyszerek és antitestek 13 2.1.3 Humán monoklonális antitestek 14 2.1 .4 Sejtvonalak 15 2.1.5 Fogyóeszközök és laboratóriumi felszerelések 15 2.1.6 Szoftver és hardver 16 2.2 Az immunhisztokémia módszerei 17 2.2.1 Fagyasztott szakaszok elkészítése 17 2.2.2 Ficoll gradiens és citospinek előállítása 17 2.2.3 Kriozekciók és citospinek immunoperoxidáz festése 18 2.3 Sejtbiológiai módszerek 20 2.3.1 Sejtkultúra 20 2.3.2 Proliferációs teszt (MTT assay) 20 2.3.3 Sejthalál-detektálás ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 21

3 Eredmények 23 3.1 Immunoperoxidáz festés 23 3.1.1 Kolorektális karcinómák 24 3.1.2 Normál szövet 28 3.1.3 Magzati szövet 34 3.1.4 Tumor szövet 35 3.2 Proliferációs teszt (MTT assay) 39 3.3 Sejtpusztulás detektálása ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 42 4 Megbeszélés 45 5 Összegzés 58 6 Irodalomjegyzék 59 7 Rövidítések listája 75 Köszönetnyilvánítás CV

Bevezetés 11 1.3 Az értekezés célja Ebben a dolgozatban három humán monoklonális antitestet fejlesztettek ki, amelyeket Dr. Prof. munkacsoportban fejlesztettek ki. H.P. A Würzburgi Egyetem Patológiai Intézetének Vollmerjeit hibridóma technológia segítségével (leírás: Vollmers et al., 1989) izoláltuk egy végbélrákos betegetől, egészséges és rosszindulatú degenerált szövetekkel való keresztreaktivitás szempontjából vizsgáltuk. Erre a célra immunoperoxidáz foltokat hajtottak végre különféle normál és magzati szövetek fagyasztott szakaszain és számos daganattípuson. Ezenkívül az antitestek hatását a különböző vastagbélrákos sejtvonalak növekedési viselkedésére két funkcionális sejtbiológiai teszt (MTT assay, Cell Death ELISA PLUS) segítségével jellemzik in vitro. A jelen munka során nyert adatoknak kiindulási információkat kell szolgáltatniuk az antitestek terápiás szerként való alkalmasságáról a rosszindulatú vastagbéldaganatokban, és ezáltal esetleg további kutatási megközelítések alapját képezik.

Anyag és módszerek 12 2 Anyag és módszerek 2.1 Anyag 2.1.1 Pufferek, oldatok és közegek PBS: 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,15 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 0,2 g KH 2 PO 4 1 l A. licitáló. Tris/NaCl: 1. oldat: 4,5 l A. redisztáljuk. 40,5 g nátrium-klorid-oldat 2: 1 liter A. redisztáljuk. 6 g trisz (hidroxi-metil) -amino-metánt állítson pH = 7,6-ra füstölgő HCl-beállító oldat és 500 ml 2. oldat pH-jával 7,4 BSA/PBS: 5 mg BSA (szarvasmarha-albumin, V frakció; Roth, Karlsruhe)/ml PBS DAB reagens: 5 ml csapvíz, 1 DAB tabletta, 1 hidrogén-peroxid tabletta (5 ml Sigma Fast 3,3'-Diaminobenzidin tabletta; Sigma, Steinheim) MTT reagens: 3- (4,5-dimetil-tiazol-2- il) -2,5-difeniltetrazolium-bromid (Sigma, Steinheim) 5 mg/ml PBS sovány tejpor: az egészséges élelmiszerboltból, 3 vagy 5% PBS-ben

Anyag és módszerek 13 Trypan kék: 0,5% Trypan kék (Sigma, Steinheim) 0,9% NaCl Nyúl szérum: Linaris, Wertheim-Bettingen Humán szérum: a Würzburgi Egyetem Transzfúziós Orvostani Tanszékétől RPMI 1640: alap táptalaj (500 ml) (PAA Laboratories, Linz/Ausztria) 1% glutamin (5 ml) 1% penicillin/sztreptomicin (5 ml) 10% FCS (magzati borjúszérum) (50 ml) felhasználás előtt előmelegszik 37 ° C-ra Trypsin/EDTA: PAA Laboratories, Linz/Ausztria 2.1. 2 Vegyszerek és antitestek A vegyi anyagokat és antitesteket a következő vállalatoktól szerezték be: Acetone Cell Death Detection ELISA PLUS DMSO (dimetil sulfoxid) Fico Lite H elválasztó táptalaj Glicerin zselatin Haemalaun Tissue-Tek Mallinckrodt Baker, Deventer/Hollandia Roche, Mannheim Merck, Darmstadt Linaris Better, Wertheim Merck, Darmstadt Merck, München Sakura Finetek, Zoeterwoude/Hollandia anti-citokeratin (CAM 5.2) reagens Becton Dickinson, Belgium

Anyagok és módszerek 15 2.1.4 Sejtvonalak A kísérleteket a kialakult HT-29, CACO-2, COLO 206F és COLO 320 vonalakon hajtottuk végre. A COLO 320 kivételével mindegyik tapadó növekedést mutat a tenyészpalackban. A termesztést RPMI 1640 táptalajban/1% glutamin/1% penicillin/sztreptomicin/10% FCS-ben végezték 37 C-on és 7% CO 2 -on. Diák, pipettacsúcsok, reakcióedények és műanyag edények, S-monovetta és kanül, sejttenyésztő lemezek és palackok, citofilter kártyák, Eppendorf, Hamburg, Laboratóriumok Szövetségének szakembere, Hartenstein, Würzburg Menzel; Langenbrinck, Emmendingen Greiner, Frickenhausen; Hartenstein, Würzburg Greiner, Frickenhausen; Hartenstein, Würzburg Sarstedt, Nümbrecht Greiner, Frickenhausen Hartenstein, Würzburg A munkához használt eszközök a következő vállalatoktól származnak: Aquabidest system Milli-Q Plus PF inkubátorok ELISA olvasók Millipore, Molsheim Heraeus, Hanau Bio-Rad, München

Anyag és módszerek 16 Fagyasztó (-70 C) Kriosztát 2800 Frigocut N Hűtőszekrény és fagyasztó mágneses keverő IKAMAG RTC mikroszkóp DMLB fázis kontrasztmikroszkóp DMIL ph-meter ph 525 pipetta 2 Heraeus, Hanau Reichert-Jung, Nussloch Quelle, Fürth Janke & Kunkel, Staufen Leica, Wetzlar Leica, Wetzlar WTW, Weilheim i. Eppendorf polgármester, Hamburg Brand, Wertheim/Main Heraeus, Hanau Bender & Hobein, Zürich/Svájc Sartorius, Göttingen Dinkelberg-Labortechnik, Neu-Ulm Heraeus, Hanau Shandon, Nagy-Britannia 2.1.6 Szoftver és hardver Az eredmények grafikus ábrázolásához Használt EXCEL és POWERPOINT (Microsoft, USA) programok. A szövetrészek fényképfelvétele a Nikon Coolpix 990 digitális fényképezőgép (Nikon, Japán) és a DMLB mikroszkóp (Leica, Wetzlar) segítségével történt 100, 200 és 400-szoros nagyítással, a nyomtatás pedig fotópapírra készült (Hewlett Packard, USA). azonos márkájú színes nyomtatóval.

25. eredmények A HH 98/81-33-154 és a HH 99/71-81-149 festés eredményei egyaránt megegyeztek, és amikor ez a két antitest pozitívan reagált, a HH 101/99-14 festés is pozitív volt . Ez összesen 7 karcinóma esetében volt így. Az 1–4. Ábrák a HH 98/81-33-154 és a HH 99/71-81-149 pozitív festés, valamint a HH 101/99-14 kolorektális tumorszövetre gyakorolt ​​gyengébb és erősebb reakciójának példáját mutatják be. Összehasonlításképpen, mindhárom antitest negatív reakciói a nem neoplasztikus vastagbélszövetekkel az 5. ábrán láthatók. a b c 1. ábra: Adenocarcinoma vastagbél nagyítás: 100-szorosa: pozitív kontroll (CAM 5.2) b: negatív kontroll (L11/64-28) c: pozitív reakció a HH 98/81-33-154 antitesttel

Eredmények 26 abc 2. ábra: Adenocarcinoma vastagbél nagyítás: 10x a: Pozitív kontroll (CAM 5.2) b: Negatív kontroll (RPMI 1640) c: pozitív reakció a HH 99/71-81-149 abc antitesttel 3. ábra: Adenocarcinoma vastagbél nagyítás: 10-szeres: pozitív kontroll (CAM 5.2) b: negatív kontroll (L11/64-28)) c: gyengén pozitív reakció a HH 101/99-14 antitesttel

27. a b c d 4. ábra: A pecsétet tartalmazó pecsétgyűrűsejtek adenokarcinóma Nagyítás: 200-szor a: HE festés b: pozitív kontroll (CAM 5.2) c: negatív kontroll (RPMI 1640) d: erősen pozitív reakció a HH 101/99-14 antitesttel

Eredmények 28 abcd 5. ábra: normális szöveti vastagbél nagyítás: 200-szor a: negatív kontroll (L11/64-28) b, c, d: a HH 98/81-33-154, HH 99/71-81-149 és HH antitestek negatív reakciói HH 101/99-14 nem daganatos vastagbélmirigyekkel 3.1.2 Normál szövet Mivel az antitestek által felismert daganattal társult antigének olyan molekulák lehetnek, amelyeket egészséges sejtek is expresszálnak, meg kell határozni a sejtek lehetséges keresztreakcióit. Fontos szervekkel rendelkező antitestek feltárása annak érdekében, hogy kezdeti következtetéseket lehessen levonni az antitestek kompatibilitásáról a későbbi terápiás alkalmazás során.

Eredmények 30 Orgona száma HH 98/81-33-154 HH 99/71-81-149 HH 101/99-14 talált. + + + Vastagbél 3 0 3 0 3 0 3 Végbél 3 0 3 0 3 0 3 Hasnyálmirigy 2 0 2 0 2 0 2 A máj 3 nem értékelhető A lép 3 nem értékelhető Thymus 3 0 3 0 3 0 3 Tonsilla 3 0 3 0 3 0 3 nyirokcsomó 3 0 3 0 3 0 3 mellékvese 3 0 3 0 3 0 3 vese 3 0 3 0 3 0 3 hólyag 3 0 3 0 3 0 3 ductus deferens 3 0 3 0 3 0 3 prosztata 3 0 3 0 3 0 3 herék 3 0 3 0 3 0 3 mell 3 0 3 0 3 0 3 petefészek 3 0 3 0 3 0 3 tuba uterina 3 0 3 0 3 0 3 corpus uteri 2 0 2 0 2 0 2 méhnyak uteri, portio vag. 2 0 2 0 2 0 2 bőr 3 0 3 0 3 0 3 vázizom 3 0 3 0 3 0 3 placenta 1 0 1 0 1 0 1 gerincvelő 3 0 3 0 3 3 0 agykéreg 3 0 3 0 3 1 2 kisagy 3 0 3 0 3 3 0 Corpus pineale 2 0 2 0 2 2 0 Agyalapi mirigy 3 0 3 0 3 3 0 Csontvelő 2 0 2 0 2 0 2 Vér 2 0 2 0 2 0 2