Hyperandrogén egérmodell a policisztás petefészek-szindróma protokoll tanulmányozásához (németre fordítva)
Összegzés
Leírjuk egy sovány PCOS-szerű egérmodell kifejlesztését pellet-dihidrotesztoszteron felhasználásával a PCOS patofiziológiájának és ezeknek a PCOS-szerű gátaknak az utódainak tanulmányozására.
Absztrakt
A hiperandrogenémia döntő szerepet játszik a nők reproduktív és metabolikus működésében, és ez a policisztás petefészek-szindróma jellemzője. Klinikailag releváns egy vékony PCOS-szerű egérmodell kifejlesztése, amely utánozza a PCOS-ban szenvedő nőket. Ebben a protokollban egy ilyen modellt írunk le. 4 mm hosszú DHT (dihidrotesztoszteron) kristálypor-pellet behelyezésével (a pelletek teljes hossza 8 mm), és havonta cserélve használhatunk egy PCOS-szerű egérmodellt, amelynek szérum DHT-szintje kétszer magasabb, mint a nem beültetett egerek DHT (nem DHT) előállításához. A reproduktív és metabolikus diszfunkciókat figyeltük meg anélkül, hogy megváltoztattuk volna a testsúlyt vagy a testösszetételt. Noha magas szintű meddőséget mutat, ezeknek a PCOS-szerű nőstény egereknek egy kis része teherbe eshet, utódaik pedig felnőttként késleltetett pubertást és emelkedett tesztoszteronszintet mutatnak. Ez a PCOS-szerű vékony egérmodell hasznos eszköz a PCOS-szerű gátak és a PCOS patofiziológiájának és utódainak tanulmányozásához.
Bevezetés
Ez az új paradigma (az NIH és az AE-PCOS társadalmi kritériumok relevánsak) modellezi a betegséget azzal, hogy viszonylag hasonló androgénszinteket termel, mint azok a nők, akiknél a PCOS 2-3-szor magasabb tesztoszteron- vagy DHT-szinttel rendelkezik, mint az érintett nőknél. Ezt a modellt azonban állandó exogén DHT tartja fenn, és nem a programozott endogén hiperandrogenizmus, ha a DHT visszavonásra kerül. A cikk általános célja, hogy 1) a DHT pelletezésére összpontosítson; (2) hogyan lehet előállítani egy Lean PCOS-hoz hasonló egérmodellt; (3) Stratégiák az e gátakból származó női utódok értékelésére. A fenotípusok egyéb méréseivel és értékelésével ez a kézirat nem foglalkozik, de megtalálhatók az 5, 15, 23, 24, 25, 26.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Itt mutatjuk be a DHT pellet előállításának és beépítésének, valamint a reproduktív és metabolikus tesztelésének részletes protokolljait. Az ebben a vizsgálatban használt egerek vegyes háttérrel rendelkeztek (C57/B6, CD1, 129Sv), és táplálékkal és vízzel ad libitum mellett gondozták őket 14/10 órás világos-sötét ciklusban, 24 ° C-on a Broadway-ben. Animal Facility Research Building a Johns Hopkins Egyetem Orvostudományi Karán. Valamennyi eljárást a Johns Hopkins Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.
1. Hozzon létre PCOS-szerű egérmodellt
2. Értékelje a krónikusan DHT-beillesztett gátakból származó női utódok szaporodási profilját
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Szérum DHT szint és glükóz tolerancia teszt
A DHT-szinteket az összegyűjtött szérumból ELISA-val és LC-MS-sel mértük az 1.24-1.25 és a 2.9, 3.0 protokoll szerint. A DHT abszolút értékei különböznek a tömegspektrometriától és az ELISA-tól, azonban a DHT és a nem-DHT inzert relatív hajtása mindkét vizsgálatban és a 15., 23., 24. kísérletben hasonló ((kb. Kétszeres) 2A. Ábra). A DHT-szintek a terhesség miatti előítéletek miatt jelentősen megemelkedtek a DHT-s és a nem-DHT-egerekben, de a DHT-szintek kétszer magasabbak a DHT-egerekben, mint a nem-DHT-egerekben mindkét pregesztációs időpontban (egy nappal a párzást megelőzően) ) és a terhességi kor (kb. 14 nap) szorzata (2. ábra b). Mivel az ELISA és az LC-MS megkülönbözteti a DHT abszolút szintjét, a vizsgálatokon belül kiszámítjuk a relatív szinteket (szeres változás: DHT-szint DHT-beiktatással szemben, illetve nem-DHT-inszercióval). A DHT-ben szenvedő nőstény egereknél a glükóz tolerancia romlott a no-DHT-hez képest 2 héttel a DHT beillesztése után az 1.23 protokoll szerint (3. ábra).
Női utódok testsúlya és pubertása
Míg általában steril, néhány gát terhes, és kölykei vannak (kb. 30% -os vemhességi arány, tehát 10 vizsgálatból kapunk termékenységi gátakat, általában 3 vemhes anyát, lásd a 2.1. Protokollt). Ezért értékelhetjük a gátak krónikus androgén hatásait a női utódokra. A DHT-beültetett gátak női leszármazottjait DHT-lányoknak, a DHT-n kívüli gátakét pedig DHT-leányoknak nevezzük. Nem észleltünk különbséget a nem-DHT és a DHT lányok között a hüvelynyílás korában. Azonban a DHT lányok esetében az első ivarzás jelentősen késik (DHT nélküli lány esetében a 35. nap, a DHT lányának a 42. nap). Ez a DHT lányok 35 és 42 PND-ben bekövetkezett csökkent testtömegével jár együtt a DHT nélküli lányokhoz képest (4. ábra; lásd a 2.4 - 2.7 protokollt).
Hormonszint és ösztrikus ciklikusság a női utódokban
A tesztoszteronszint 21 PND-ben nem változik, de 26PND-ben csökken. A tesztoszteron azonban megemelkedik 70 PND-nél (5. ábra, lásd a 2.9-3.0 protokollt). A felnőtt DHT lányok zavart ösztrikus ciklikusságot mutattak a felnőtt, nem DHT lányokhoz képest, szignifikánsan hosszabb idő m/d, és kevesebb idő volt P és E (6A. Ábra), B.; 1.17 - 1.22 protokoll szerinti módszer szerint.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
A hiperandrogenizmus a PCOS egyik legfontosabb jellemzője. Az ebben a protokollban alkalmazott szérum DHT-szintek (kétszer magasabbak a DHT-egerekben, mint a nem-DHT-egerekben) alacsonyabbak, mint amelyeket más kutatók az előző vizsgálatokban közöltek, és azokat a PCOS 5-tel arányosan utánzó nőkhöz kalibrálják, 19, 20, 21. Más modellekkel ellentétben ez a kétszeres DHT modell nem változtatja meg a testsúlyt és az egész test összetételét a DHT nélküli egerekhez képest, legfeljebb 3,5 hónappal a DHT behelyezése után 23, 24. Ezeket a DHT-beültetett felnőtt egereket állandó exogén DHT tartja fenn. Bár az egész test összetétele nem változik, a sovány PCOS nőknél megfigyelték az adipocyták szerkezetének és működésének változását 20. A különböző raktárak gondos vizsgálata garantált. Megfigyeltük az ösztrikus ciklikusság romlását a DHT-beillesztést követő egy héten belül, 15 pedig a termékenységet egy három hónapos termékenységi besorolás alatt 23.
A DHT-vel kezelt nőstény egerek kis részhalmaza, amely teherbe eshet és utódokat hozhat, lehetőséget adott a terhesség előtti, terhességi és ápoló hiperandrogenémia magzati fejlődésre gyakorolt hatásainak értékelésére. A megfelelően ellenőrzött kísérlet megszerzéséhez több tenyész szuka szükséges, amelyhez legalább 10 párosodási pár létrehozása szükséges. A DHT lányai csak terhesség alatt és 21 PNA előtt vannak kitéve DHT-nek. A DHT lányai kisebb testtömeget mutattak a DHT nélküli lányokhoz képest, jelezve, hogy az elhízás vagy a túlsúly nem volt zavaró változó a megfigyelt fiziológiai hatásokban 15 .
Az első vizsgálatok során a szérum DHT-szintjét idővel validáltuk. Nem találtunk szignifikáns különbséget a szérum DHT-ben az 1., 2., 3. és 4. héten, 23, 24. A DHT szintje 4 hét után csökkent, ezért 4 hetente cseréljük a DHT pelletet. Nem figyeltük meg a DHT csökkent hatásait, amelyeket szintén 3 hónapig tároltunk szobahőmérsékleten. Fontos, hogy a pelleteket a behelyezés előtt 24 órán át sóoldatban inkubálja. Ez a lépés fontos a pelletből történő egyenletes DHT-felszabaduláshoz (a DHT lassan szabadul fel a Silastic csöveken keresztül). Az ösztrikus ciklikusság 3 napos DHT behelyezés után ellenőrizhető, és a hüvelyi kenetet közvetlenül a sóoldatban is megvizsgálhatjuk vegyszer és folt nélkül, fénymikroszkóp alatt, miután megismerkedtünk a 27 sejt típusával.
A metabolikus fenotípus 2 hét (14 nap) DHT-beiktatás után vagy azt követően értékelhető. A DHT metabolizmusra gyakorolt hatása azonban a negyedik hét (28 nap) végén enyhén gyengül, bár a reproduktív diszfunkció csökkenését nem észlelik. Ezért általában az anyagcsere funkciót a 2., 3., 5., 6., 7. hét végén értékeljük (14, összesen 21, 35, 42 és 49 nap 2-szeres beillesztése). A laboratóriumi lassú felszabadulású szteroid pelletgyártás kiforrott technika, amelyet számos laboratórium széles körben alkalmazott 33,34. Olcsó alternatívát jelent a kereskedelmi termékeknél, amelyek meghaladják az 50 dollárt/pellet (90 napos DHT-pelletek, mint 5 mg/pellet, IRA, NA-161). A kereskedelmi terméknek az az előnye, hogy 90 napig nem kell cserélni, míg az ebben a jelentésben leírt pelletet 28 naponta cserélni kell. Nagyszabású vizsgálatokhoz a kutatók gazdaságosabbnak találhatják saját pelletgyártásukat, még akkor is, ha a pelletek cseréje 4 hetente szükséges.
Ahogy mások is megfigyelték, a krónikus szülés utáni DHT beültetéssel rendelkező modellek nem mutatnak megnövekedett LH pulzáló gyakoriságot, és ez jelezheti a megnövekedett androgén által indukált reproduktív funkció különböző kóros mechanizmusait a fejlődési és a későn megszerzett hiperandrogenizmus között. Ezzel a protokollal megvizsgálhatjuk a krónikusan hiperandrogén gátakból származó női utódokat. Ezzel a modellel megpróbálhatjuk megérteni a reproduktív (pl. Tüszőfejlődés, ovuláció (Corpora Lutea) és termékenység) és metabolikus következményeit (pl. Glükóz vagy lipid anyagcsere, testösszetétel, zsírraktár. (Eloszlás). új eszközt ad az emelkedett androgén által kiváltott reproduktív és anyagcsere-rendellenességek kivizsgálására, és távolságot ad az emelkedett androgén okozta patofiziológiától az elhízás okozta betegségektől. Ez a modell felhasználható az emelkedett androgének szövetspecifikus hatásainak tanulmányozására nőknél Ezenkívül az itt közölt módszertan a DHT pelletgyártásra könnyen alkalmazható a többi szteroid hormon vizsgálatára.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.