Mikrorészecskés markerek alkalmazása a Brachionus emésztési fiziológiájának tanulmányozására
Mikrorészecske markerek alkalmazása a Brachionus plicatilis (Rotatoria) emésztési fiziológiájának vizsgálatára. INAUGURÁLIS ÉRTEKEZÉS a kölni egyetem matematika és természettudományi karának doktori fokozatának megszerzésére Nicole Anita Lindemann, Duisburg Köln 2001
Előadó: Prof. Dr. W. Kleinow Prof. Dr. M. Dambach Prof. Dr. H. Arndt A szóbeli vizsga napja: 2001. május 11
Tartalomjegyzék 3.2.4 A miliőfaktorok hatása az étel áthaladására 96 3.2.4.1 A ph érték mikroszkópos vizsgálata a B. plicatilis gyomrában és bélében 96 3.2.4.2 A pH-érték hatása a tápközegben 102 3.2.4.3 Az abszorpció és a szűrési sebesség összehasonlítása pufferolt táptalaj 105 3.2.5 Abszorpciós folyamatok vizsgálata a B. plicatilis emésztőrendszerében 116 3.2.5.1 Hemoglobin felszívódása 116 3.2.5.2 A fehérjék felszívódásának közvetlen kimutatása 121 3.3 Záró megjegyzések és általános vita 125 4. Összefoglalás 130 5. Bibliográfia 132 Köszönetnyilvánítás Magyarázat önéletrajz
Absztrakt A B. plicatilis emésztőrendszerének tartalma gyorsan és egyszerűen kicserélhető, ha új típusú részecskéket juttatunk a táptalajba. Élesztősejteket használtak az emésztőrendszer vörösvértestjeinek pótlására és a rotiferek tápanyagrészecskék bevitelének ellenőrzésére való képességének vizsgálatára. A bróm-timolkékkel festett élesztősejtek lehetővé teszik a gyomor és a belek ph-értékeiben mutatkozó különbségek meghatározását. Ezenkívül etetési kísérletek során ezek a sejtek hasznosak a H + -ionok bél szekréciójának különbségeinek vizsgálatára a különböző molaritású tápközegben. Végül az abszorpciós folyamatokat be lehet mutatni úgy, hogy a fluoreszcenciával jelölt eritrocita szellemeket fel nem cserélt szellemekkel helyettesítjük, és a gyomorsejtekben tartósan fennmaradó fluoreszcenciát detektálunk. 2
Anyag és módszerek 2. Anyag és módszerek 2.1 Gyakran használt rövidítések DTT FITC HEPES LSM MES RSA SDS TRA Tris rpm 1,4-Dithio-DL-Threit (ol) Fluoreszcein-izotiocianát N-2-Hidroxi-etilpierazin-N -2-etánszulfonsav Lézeres letapogatás -Mikroszkóp N-morfolin-etánszulfonsav szarvasmarha-szérum albumin-nátrium-dodecil-szulfát-trietanol-amin-hidroklorid-trisz (hidroxi-metil) -amino-metán fordulat/perc 5
Anyag és módszerek 2.2 Vegyszergyártó, anyag Tisztasági osztály Appli Chem (Darmstadt) Albumin szarvasmarha szérumból Citrát (citromsav-monohidrát) p. a. DTT MES puffer minőségű nátrium-hidroxid p. a. Sósav p. a. Csapda. a. Boehringer (Mannheim) Tris kristályos Merck (Darmstadt) brómtimol-kék-bróm-fenol-kék-glutáraldehid oldat 25% -os kálium-klorid old. a. Kálium-hidrogén-foszfát p. a. Kálium-hidroxid tiszta magnézium-szulfát 7-hidrát p. a. Nátrium-karbonát o. a. Nátrium-klorid o. a. Nátrium-dihidrogén-foszfát 1-hidrát p. a. Nátrium-hidrogén-karbonát o. a. dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát p. a. Nátrium-ditionit Sera (Heinsberg) tengeri só keverék 6
Anyag és módszerek Gyártó, anyag Tisztasági szint Serva (Heidelberg) Klóramfenikol Heparin SDS Szacharóz (szacharóz) kutatási fokozat kutatási fokozatú kristályos Sigma (München) FITC HEPES Litikáz (Arthrobacter luteusból) Mertiiolát (Timerosal) Riedel-de-Haën (Hannover) Ammónium-hidrogén-karbonát A fel nem sorolt vegyi anyagok (pa minőségben) a Merckből, Darmstadtból származnak. Eltérő rendelkezés hiányában az alkalmazott oldatokat összekeverjük az Aqua bidest oldattal. Ütemezett. 7.
Anyag és módszerek 2.3 Különleges anyagok BRAND (Wertheim/Main) Heparinizált mikro-hematokrit kapillárisok (hosszúság: 75 ± 1,00 mm; belső átmérő: 1,15 ± 0,05 mm; külső átmérő: 1,55 ± 0,05 mm), Számláló kamra, Neubauer (kamra mélysége: 0,1 mm; számláló hálózat: 9 nagy négyzet, 1 mm 2) BRAUN (Melsungen) steril vérlancett, Solofix CORNING COSTAR GmbH (Bodenheim) Tanswell-Clear poliészter membrán (átmérő 24 mm, pórusméret 0,4 µm) PLANO (Wetzlar) Prep-Eze: kosár (A típus), 75 µm szembőségű cellulózból készült ROTH (Karlsruhe) dialízis csővel, Spectra/Por Membrane 3, MWCO: A Zoológiai Intézet (Kölni Egyetem) szűrőberendezés (Lindemann & Kleinow) 3500 műhelye, 2000), lásd az 1. ábrát, amely egy szorosan lezárt bélyegzővel ellátott PE csőből és két zárható kivezetésből áll. A bélyegzőt Polymon gézzel fedjük le (PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, szembőség 16 µm). 5 ml-es FORTUNA OPTIMA üvegfecskendőből (Walter Graf and Co. GmbH & Co., Wertheim) készült kis szűrőberendezés gézzel borított (Polymon Gaze PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, 16 µm szembőségű) PE bélyegző; A fecskendő kimenete tömlőprésszel zárható. 8.
Anyag és módszerek 10 cm B A C 1. ábra: Szűrőberendezés rotifotorok töményítésére vagy apró részecskék (eritrociták, algák vagy élesztősejtek) eltávolítására a rotifer tartalmú közegből. Szorosan lezárt bélyegző, Polymon gézzel (16 µm szembőségű) B lefolyóval lefedve a C közeg mosásához C elvezetés részecskék nélküli, koncentrált rotifoterekhez 9
Anyag és módszerek 2.4 Mikroszkópos megfigyelés módszerei 2.4.1 Fénymikroszkóp A következőket alkalmaztuk: a) Laborlux K áteresztett fénymikroszkóp (Leitz, Wetzlar, nagyítás 40 és 1000 között). b) Wilovert áteresztõ fényváltó mikroszkóp (Will, Wetzlar, nagyítás 40 és 320 között). 2.4.2 Fluoreszcens mikroszkóp A fluoreszcencia vizsgálatokat Orthoplan fluoreszcens mikroszkópon (Leitz, Wetzlar, 63-400 nagyítás) végeztük az L2 450-490 gerjesztőszűrővel (510 osztó, 525/20 blokkoló szűrő). Az állatokat fedőüvegek alatt mikroszkóp tárgylemezeken figyeltük meg. 2.4.3 Mikroszkóp képek A fénymikroszkóp képeket egy Minolta X-300 reflex kamerával készítették Leitz Periplan lencserögzítéssel (GF 12.5; TL 160 mm 10). A következő filmeket használták: Ilford PAN F Plus 50 ASA (fekete-fehér negatív film), Kodak EKTAR 100 ISO 100/21 (színes negatív film), Kodak EKTAR 1000-2 (színes negatív film), Kodak Royal Gold 100 ISO 100/21 (színes negatív film) ), Scotch CHROME 640-T ISO 640/29, 3200 k (színes diafilm az izzólámpa fényéhez). Kék szűrőt használtunk a mesterséges fény okozta enyhe sárga árnyalat kompenzálására. 10.
Anyag és módszerek 1 2 2. ábra: Elrendezés az egyes állatok hosszabb ideig történő megfigyelésére. A Pyrex üvegkapilláris () segítségével a helyén tartott állatokat invertált mikroszkóppal figyeljük meg az etetőközegben. Az üvegkapillárt egy mikromanipulátor tartja és vezeti. A tartó kapilláris negatív nyomását 2 ml-es fecskendő () segítségével ellenőrizzük. 1 = mikromanipulátor, 2 = tárgylemez 1 ml-es rögzítéssel. 16.
Anyagok és módszerek 2.5.4 Rotifotorok immobilizálása nátrium-ditionit-nal A nagyszámú rotifotor mikroszkópos vizsgálatához az állatokat nátrium-ditionit-tal immobilizáltuk. 500 μl rotort tartalmazó táptalajt injektáltunk egy Eppendorf-reakcióedénybe 500 μl nátrium-ditionit (40 mg/ml) adagolásával. A kezelés után a rotiferek teljesen kihúzott állapotban az edény aljára süllyednek. Az állatok teljes számának és a megtöltött (vörös színű) emésztőrendszerrel rendelkező állatok számának meghatározásához a rotifuerek koncentrációjától függően 20-100 μl-t pipettáztunk az edényből egy üreges, őrölt üveglemezre. 2.5.5 Az oldódási puffer előállítása A von Kleinow et al. (1991) által kifejlesztett oldódási puffer a következőképpen történt: 2 ml desztillált vízben. 0,18 M SDS-t és 0,03 M ammónium-hidrogén-karbonátot oldunk (pH 8). A kísérlet megkezdése előtt 0,04 g DTT-t adunk az oldathoz. 17-én
Anyag és módszerek 2.6.4 Eritrocita szellemek 2.6.4.1 FITC albumin előállítása (Wißling, 1988 és Johnson & Halborow, 1986) Annak megakadályozása érdekében, hogy a fluoreszcens festék diffundáljon a szellemekből, fehérjéhez kötődött: 0,5 M lúgosabb A puffert (pH 9,5) 5,8 ml 5,3% -os Na2C03 oldat hozzáadásával 10 ml 4,2% -os NaHCO 3 oldathoz adtuk. 50 mg albumint felvettünk 4,5 ml 0,9% -os NaCl-oldatba, majd 0,5 ml lúgos puffert adtunk hozzá, alapos keverés után 1,5 mg FITC-t adtunk hozzá, és az oldatot 2 órán át 22-25 ° C-on kevertük. Ez az elegy egy éjszakán át dializált 4 liter fiziológiás sóoldattal szemben, dialízis-hintázóban. A kész fluoreszcencia-fehérje komplexet hűvös és sötét helyen tároltuk. 2.6.4.2. Oldatok Mosóoldat: hipozmotikus puffer: Mosópuffer: 0,9% NaCl oldat 5 mm MgSO 4 oldat 160 mm KCl/5 mm HEPES oldat, pH 7,4. Az összes oldatot a szellemek előállításához kb. C lehűtött. 2.6.4.3 Terhelt és betöltött szellemek előállítása Friss heparinizált emlősvért (juh vagy szarvasmarha) 5000 fordulat/perc sebességgel, 4 ° C-on 10 percig centrifugáltunk. A plazma felülúszó és a sejtoszlop felső leukocita tartalmú rétegének dekantálása után a Sedi-20
Anyag és módszerek 2.6.4.4 Glutáraldehid-fixált szellemek A megterhelt szellemeket a 2.6.3 és 2.6.4 szakaszban leírtak szerint készítettük el és rögzítettük, a glutáraldehid-oldatot előzetes mosás nélkül adtuk az előkészített és lehűtött szellemekhez. . 22-én
Anyag és módszerek Mintavétel szűrőkosárból Rotifers Erythrocytes 3. ábra: A mintavétel sematikus ábrázolása: A fotometriai mérésekhez a mintát az eritrociták számára hozzáférhető szűrőkosárból pipettázzuk, de a rotifords nem. Ezt 2-3 szövetkosár (75 µm szembőségű, Plano GmbH Wetzlar) ragasztásával érték el. Az első órában mintát vettünk 5-10 percenként, a vizsgálat további folyamán csak 20-30 percenként. Amikor a mintákat vettük, 2 ml-t pipettáztunk a szűrőkosárból egy küvettába. Annak biztosítása érdekében, hogy a szűrőbetétben lévő szuszpenzió nagyjából megfeleljen a vörösvértestek koncentrációjának vagy a felszabaduló hemoglobin koncentrációjának a környező közegben, a szűrőkosár tartalmát pipetta segítségével többször átvittük a külső közegbe, mielőtt minden mintát vettünk volna. 24.
Anyag és módszerek 2.7 Az élesztősejtek előállítása 2.7.1 Az élesztő-szuszpenzió előállítása 0,5 g sütőélesztőt (Saccharomyces cerevisiae) 100 ml tengervízben addig keverünk, amíg az élesztő egyenletesen eloszlik. 2.7.2. A foszfátpuffer előállítása Sørensen szerint 0,2 M foszfátpuffer (pH 7,0) előállításához 30,5 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 oldatot és 19,5 ml 0,2 M NaH 2 PO 4 - Megoldás készült. 0,067 M Sørensen puffert nyertünk, amikor 6,7 rész puffert hígítottunk 13 rész desztillált vízzel. (Dawson és mtsai., 1969). 2.7.3 A kálium-foszfát puffer előállítása A KH2P04-et (0,05 M) desztillált vízben oldjuk. pH-t KOH-val 7-re állítottuk be. 2.7.4 Az élesztősejtek festése indikátorfestékkel A Klaus Kühle (1983) által használt "Preis Microplan" élesztősejtek helyett friss sütőélesztőt használtak, hogy az első centrifugálási lépést el lehessen hagyni. A következő lépéseket hajtottuk végre az élesztősejtek indikátorfestékkel történő festésére: 250 mg friss sütőélesztőt szuszpendáltunk egy kémcsőben 5,0 ml 1/15 M foszfátpufferben (Sørensen), pH 7,0. - 25 mg brómtimolkék (indikátor tartomány: pH 6,0-7,8; színváltozás sárga (savas) kékről (bázikus)) vagy bróm hozzáadása
a b c d 4a-d. ábra: Az eritrociták felvétele és továbbadása a B. plicatilis emésztőrendszerében. Tipikus szekvencia az eritrociták 0. időpontban történő hozzáadása után, egy rotiferen figyelhető meg, amelyet szívással tartottak egy Pyrex üvegkapilláris nyílásánál. Ennél a nagyításnál nem sikerült az egész állatot fényképezni a fókuszban. Az állatok közegben történő mozgása miatt rövid expozíciós időket kellett választani nagy nyílással. Kalibrációs sáv = 100 µm. a) 10-20 másodperc múlva a gyomor kissé piros színűvé válik. b) 180 másodperc múlva a gyomor egyértelműen tele van, és a bél első színe látható. c) 15 perc elteltével a gyomor és a belek intenzíven vörös színűek. d) 17 perc elteltével a belek tartalma a végbélnyíláson keresztül távozik. Az első folyamatot követő átjárási folyamatokat általában felgyorsították, így a következő bélkiürítésre mindössze 10 perc múlva került sor. Az összes alkalmazott emlős vörösvértestben (emberek, szarvasmarhák és juhok) csak a membrán töredékei és a felszabadult hemoglobinból álló vörös színfelhő látszott a székletben, amely gyorsan elterjedt a közegben. Egyes esetekben, amelyek még mindig láthatók az első bélmozgás során, 30
Ha ezeket a problémákat meg lehet oldani, elképzelhető lenne a további vizsgálatokhoz olyan szellemek használata, amelyeket fluorogén enzim szubsztrátokkal töltöttek meg. Ezt a módszert pl. Lokalizálja az enzimeket az emésztőrendszerben. a b 5a-b. ábra: A rotifer fénymezõs és fluoreszcens fotózása 5 perccel FITC-jelölt albuminnal (kalibrációs sáv = 50 µm) töltött szellemekkel való etetés után. 50 μl FITC albumin szellemeket tartalmazó szuszpenziót adtunk 500 μl rotifereket tartalmazó táptalajhoz. A részecskék öt percig tartó felvétele után a rotifereket megszabadítottuk a szabad fluoreszcencia szellemektől, többször átöblítve őket egy 16 μm-es nejlonszűrőn, és egy állati mintát egy tárgylemezre helyeztünk egy fedőlappal. a) Fluoreszcencia kép, b) Az emésztőrendszerben a fluoreszcencia lokalizálásához az a képet megfordítottuk, és ugyanazon állat fényes mezőképére helyeztük. 33