PDF 3 Anyagok és módszerek - Ingyenes letöltés PDF

Rövid leírás

1 3 Anyag és módszerek 3.1 Kísérleti elrendezés, állati anyag, tartás és etetés Két kísérleti futtatásban .

Leírás

Kísérleti beállítás, állati anyag, tartás és etetés

Az emésztési viszkozitásnak a sertések vékonybélének morfológiájára és szövettanára gyakorolt hatását két kísérletben vizsgáltuk. Ennek érdekében egy kontroll csoportot és egy teszt csoportot állítottak össze, amelyek mindegyike hat sertésből állt. Az első próbaüzemben félszintetikus adagot adtak kukoricakeményítő és szójafehérje izolátum alapján (C diéta). Az emésztési viszkozitás növelése érdekében a kristályos cellulóz 2% -át helyettesítették a nagyon viszkózus karboxi-metil-cellulóz szubsztráttal (diétás CMC). A második próbaüzemben olyan étrendet tápláltak, amely főleg rozsból és búzából állt, és így természetes viszkozitást növelő tényezőket tartalmazott (K étrend). A tesztcsoport digesta viszkozitását (E diéta) egy xilanáz-tartalmú enzimkészítmény (Zy 68; 480 NE/kg takarmány) hozzáadásával csökkentettük. Az 1. táblázat a különféle étrendek összetételeit mutatja be; A 2. táblázat a tápanyagtartalmat és a kivonat viszkozitását mutatja.

1. táblázat: A félszintetikus C és CMC diéták, valamint a gabonaalapú K és E diéták összetétele.

Összetevők [g/kg uS] kukoricakeményítő rozsbúza szójafehérje izolátum cellulóz, kristályos 1 karboxi-metil-cellulóz 2 glükóz szójaolaj monokalcium-foszfát takarmánymész, szénsavas premix3 kálium-hidrogén-karbonát magnézium-oxid lizin metionin-treonin triptofán Zy 684

680 134 50 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -

680 134 30 20 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -

658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 -

658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 0,4

1Viva Pur ® 200-as típus; Rettmaier & Sons cellulózgyárak, Ellwangen-Holzmühlen 2Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Németország 3Lohmann Animal Health & Co.KG, Cuxhaven; Tartalom kilogrammonként: 1,2 millió NE A-vitamin; 120 000 NE D3 Vit; 4 g E-vitamin; 200 mg Vitamin B1; 600 mg B2-vitamin; 2500 mg niacin; 400 mg B6-vitamin; 4,5 mg B12-vitamin; 20 mg biotin; 1800 mg pantoténsav; 160 gramm nátrium; 50 gramm magnézium; 10 gramm cink; 7,5 g vas; 7,5 g mangán; 150 mg jód; 70 mg kobalt; 40 mg szelén 4Lohmann Animal Health & Co. KG, Cuxhaven; A Zy 68 g-ban 1192 NE xilanáz-aktivitást tartalmaz

Anyag és módszerek 2. táblázat: A félszintetikus C és CMC étrend, valamint a gabonaalapú K és E étrend elemzett és számított tápanyagtartalma.

Szárazanyag Nyersfehérje Nyers zsír Kőris Nyersrost NfE NDF ADF Összes NSP1 (oldható)

900,7 115,0 19,9 44,6 (50) 4 671,2 * * *

896,6 116,2 25,3 32,8 (30) 4 692,3 * * *

Arabinóz (oldható) Xilóz (oldható) Mannóz (oldható) Glükóz (oldható) Galaktóz (oldható) Átalakítható energia [MJ/kg uS] 2 Látszólag pontosan emészthető nyersfehérje3 Kivonat viszkozitása [mPas]

901,9 131,9 32,9 51,3 17,0 668,6 145,9 27,4 103,4 (24,8) 19,4 (4,7) 50,2 (11,8) 4,0 (1,5) 26,0 (5,7) 3,8 (1,1) 13,4

898,9 131,9 31,4 49,7 17,3 668,6 144,6 28,0 102,6 (30,5) 19,1 (4,9) 49,4 (13,0) 2,7 (0,8) 27,8 (9,8) 3,6 (2,0) 13,4

1 meghatározása Bartelt és mtsai. (2002) 2 az egyes komponensek energiatartalma alapján számolva (DLG, 1991) 3 a rozs, a búza és a szójafehérje izolátum nyersfehérje tartalmának és emészthetőségének információi szerint számítva a CVB-ben (1996) és Grala és mtsai. (1998) 4 nem felel meg az étrend kristályos cellulóz * tartalmának

A 24 kísérleti állat a Schaumann-programból származó sertés volt. Ebben a tenyésztési programban a német Landrace és a Duroc fajták keresztezett fajtáit használják gátvonalként, a Landrace B és Hampshire fajták keresztezett fajtáit pedig apasorként. Valamennyi malac vas-dextrán injekciót kapott három napos korban; a hímeket az élet 15. napján kasztrálták. Hat malacot választottak ki véletlenszerűen két egyidejű alomból, nemtől függetlenül, és az élet 28. napján elválasztották őket. A hat alomtársat egyenletesen osztották el a kontroll és a tesztcsoport között (C vagy CMC vagy K vagy E). Az etetési periódus mindkét tesztfutásban három hétig tartott. A sertéseket külön dobozokban helyezték el, 1,20 x 1,60 m alapterületű, teljesen rácsos padlóval. Vizuális kapcsolat volt a szomszédos dobozok között. A különböző csoportokból származó sertéseknek nem volt közvetlen kapcsolatuk. 29.

Minden nap reggel 8-kor és 16-kor etették őket, a lisztszerű takarmányt háromszoros vízmennyiséggel keverve. Az adag mennyiségét úgy alakítottuk ki az ad libitum takarmányfelvételhez, hogy az első napon 100 g, a kísérlet utolsó napján pedig átlagosan 1100 g legyen. A délutáni etetés előtt a dobozokat minden nap vízzel tisztították. Ezalatt az egyes hírcsatornák három dobozát összekötötték egymással. A sertések általános állapotát naponta ellenőrizték. A kísérlet három hete alatt a sertések különféle játékokkal, például golyókkal, lekerekített fémrudakkal vagy műanyag korongokkal rendelkeztek. Az állatokat megmértük a kísérlet kezdetén, az élet 28. napján és egy nappal a kísérlet vége előtt.

majd hosszanti irányban kinyílt, végül langyos fiziológiai nátrium-klorid-oldattal háromszor öblítettük. A bélrészeket papírtörölközőkre terítették a hosszúság mérésére, és hagyták ott száradni körülbelül öt percig. Ezután az egyes szakaszokat lemértük. Minden egyes lépést ugyanaz a személy hajtott végre. A teljes eljárás során figyelmet fordítottak a sajátosságokra és a makroszkopikusan felismerhető kóros folyamatokra. Az egyes bélszakaszok testtömeghez viszonyított súlyát és hosszát egy későbbi időpontban kiszámoltuk az egyes bélszakaszok súlyának és hosszának paramétereiből. Ezenkívül a hosszúság és a súly hányadosát rögzítettük a vékony és a vastagbél falvastagságának mértékeként.

Az emésztett viszkozitás mérése

Az eltávolított digesta-t jégben lehűtjük, közvetlenül a megszerzése után, amíg a mintákat 13 000 fordulat/perc sebességgel (relatív centrifugális gyorsulás 13600 g) 10 percig centrifugáljuk (5415 C típusú centrifuga Eppendorfból, Németország). A felülúszó 0,5 ml viszkozitását egy viszkoziméter segítségével határoztuk meg (LVDV II típus; mérőfej típusú kúporsó CP-40; 40,0 ° C-ra temperált, Brookfield, USA). Ha elegendő mintaanyag állt rendelkezésre, kettős mérést hajtottunk végre. Öt állatnál a mintavételkor nem volt digesta az ileumban.

A módosított Bouin-oldatban (4% pikrinsav + 2,5% réz-acetát + 3,5% formol) történő rögzítéshez (20 óra szobahőmérsékleten) a szövetmintákat parafa lemezekre feszítették sündisznó tüskékkel. Ezt 24 órán át többször 70% -os etanollal mossuk. A készítményeket további 48 órán keresztül dehidratáltuk növekvő alkohol-sorozat segítségével (4-szer 2 óra 80%, 30 perc 90%, 2-szer 30 perc 96%, 4-szer 1 óra 100% etanol; tisztítás xilollal I, II III minden alkalommal 20 percig, mindig szobahőmérsékleten). Miután 46 ° C olvadáspontú lágy paraffinban fürdettünk, a mintákat kemény paraffinba ágyazottuk 60 ° C-on (olvadáspont 57 ° C).

A parafa lemezeken kinyújtott, körülbelül 1,5 cm2 méretű szövetmintákat 24 órán át rögzítettük a következő oldatban: 2% paraformaldehid + 2,5% glutáraldehid 0,1 M kacodilátpufferben, pH 7,2. Ezután többször öblítettük a 3.4.2. Fejezetben említett öblítőpufferrel, és utána 2 órán át szobahőmérsékleten rögzítettük a megfelelő ozmiumtetroxid oldattal. Ismételt öblítés után a mintákat növekvő alkohol-sorozaton mossuk (2x30 perc 50 és 70%; 30 perc 80% etanol I, 16 óra 80% etanol II, 2x30 perc 90 és 96% és 4x30 perc 100 % etanol (mindegyik 4 ° C-on) dehidratált. Ezt követte egy 2 órás HMDS-kezelés (1-1-1-3-3-3 hexametil-diszilazán; Roth 3840.2) szobahőmérsékleten, mielőtt a készítmények egy éjszakán át (szobahőmérsékleten) elpárologtak volna. Miután a készítményeket vezetőképes ón (Plano) segítségével a mintalapokra ragasztották, porlasztásig vákuumszekrényben tárolták (egy perc; Sputter Coater S150B, Edwards Company, Anglia).

A festés áttekintése, valamint a fénymikroszkópos proliferáció és apoptózis bizonyítékai

A morfológiai és morfometriai vizsgálatokhoz 5 µm vastag metszeteket festettünk hematoxilin-eozinnal (HE). Ezenkívül az azonos vastagságú metszeteket periodikus sav-Schiff reagenssel, Alzian Blue-val (PAS-AB) (pH 2,5) festettük. Az itt használt színezékek pH-értéküktől függően másképpen festik a serlegsejtek nyálkahártya-anyagait (mucinjait). Ez egyrészt nagymértékben leegyszerűsíti a serlegsejt kimutatását, másrészt a savas mucint kék színnel, míg a semleges mucint piros színnel mutatják be (Romeis, 1989). A mucinok további differenciálására nem került sor. A proliferáció és az apoptózis sebességének meghatározásához speciális bizonyításokat végeztek, amelyeket az alábbiakban külön-külön ismertetünk.

Szaporodás-aktív sejtek kimutatása

A kimutatási módszer elve A timidin-analóg bróm-oxiuridint (BrdU) intraperitoneálisan adtuk a sertések ante mortem-nek egy órán át, 15 mg/kg élőtömeg koncentrációban. Ez alatt az óra alatt a megváltozott uridint a sejtciklus S fázisában lévő sejtek beépítették genetikai anyagukba. A beépített BrdUridine-ket egérből származó monoklonális antitestek jelölik. A megkötött primer antitesteket a peroxidáz-anti-peroxidáz módszerrel (PAP) teszik láthatóvá, amely egy nyúl immunglobulinja, amely áthidaló antitestként szolgál (Romeis, 1989). A BrdU-t tartalmazó magok barnának tűnnek, az ehhez alkalmazott reagensek a következők voltak: SILÁNOK: A tárgylemezeket a Sigma A3648 utasításainak megfelelően vontuk be. TBS I: I mosópuffer (TRIS-pufferolt sóoldat); 0,1 M TRIS + 0,1 M NaCl + 0,05 M MgCl; pH 7,5 Inkubációs puffer: 0,05 M TRIS + 0,9% NaCl + 0,66 mM MgCl2 + 1% BSA + 0,1% zselatin (Merck 4078) TBS II: mosópuffer II; 0,05 M TRIS + 0,9% NaCl; pH 7,6 tripszin: 0,1% + 0,1% CaCl2 TBS I-ben (pH 7,6-7,8) SwNS: normál sertésszérum (DAKO X 0901); előinkubáláshoz 20% TBS I detektáló reagensekben (inkubálás): I inkubáció: MaBrdU (DAKO M 07444; egér monoklonális antitest BrdU ellen); 1:25 inkubációs pufferben + 2% SwNS 33

II. Inkubáció: RaMIg (DAKO Z 0259; nyúl antitestei az egér immunglobulinjaival szemben); 1:40 inkubációs pufferben + 2% SwNS III. Inkubáció: egér PAP (DAKO B 0650); 1: 250 inkubációs pufferben + 2% SwNS BSA:

szarvasmarha szérum albumin (Roth 8076.2)

A kimutatási módszerek alapelvei Az apoptózis során a DNS saját fragmensei a sejt saját endonukleázainak aktivitásából származnak. Ezen fragmensek szövettani kimutatásának egyik lehetősége Gavrieli és mtsai. (1992) leírt TUNEL-módszert (terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (TdT) által közvetített dUTP-biotin nick end jelölés). A terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (TdT) enzim specifikus kötődésén alapszik a DNS 3'-OH-végein. Ez az enzim biotinnal jelzett dezoxiuridin-trifoszfátokat (biotin-dUTP) kapcsol a DNS-fragmensek végéhez. A biotint végül a PAP módszerrel teszik láthatóvá. Az itt használt sztreptavidin-biotin komplex, amelyhez a peroxidázok kémiailag kapcsolódnak, helyettesíti az antitesteket (Gavrieli és mtsai, 1992). Egy másik módszerben az apoptózisra jellemző enzim, a kaszpáz-3 jelenlétét detektálják. A citoplazmában lévő enzimeket egy nyúlból származó specifikus antitest segítségével jelölik. Az elsődleges antitesteket a már említett PAP módszerrel teszik láthatóvá. Az ebben az esetben alkalmazott híd antitest egy kecskéből származik.

A TUNEL-hez használt reagensek a következők voltak: TBS: 0,05 M TRIS-HCl (pH 7,6) + 0,9% NaCl TdT puffer: 30 mM TRIS + 140 mM Na-kakodilát + 1 mM CoCl2; pH 7,2 TB puffer: 0,3 M NaCl + 0,03 M Na citrát; pH 8,0 Biotin-dUTP: Boehringer 1093 070 eredeti oldat (50 nM/50 µl), 1: 10 arányban PBS-sel hígítva; felhasznált oldat 5 nM/50 µl (részletekben -20 ° C-on tárolva) TdT:

Boehringer 220 582, borjú csecsemőmirigy; Eredeti oldat (500 U/20 µl) 1:25 arányban hígítva 50% glicerinnel PBS-ben; felhasznált oldat 500 U/500 µl (részletekben -20 ° C-on tárolva)

Szarvasmarha szérum albumin (Roth 8076.2; 4 ° C-on tárolva)

SABC-KIT: Streptavidin-biotin komplex (DAKO K0377; tárolás 4 ° C-on) DAB: 37,5 mg diaminobenzidin/150 ml TBS + 70 µl H2O2 30% -os protein-kináz; FLUKA 82456; 5, 10, 15, 20, 50 vagy 100 µl/ml TBS DNS: 0,5 U/µl (Boehringer Mannheim, 776785) Eljárás A 3 µm vastag paraffin metszeteket megfelelő tárgylemezekre húztuk, és beáztattuk a proliferáció kimutatásához. A készítményeket ezután metanolban 0,3% -os hidrogén-peroxiddal fehérítettük (30 perc), majd kétszer desztillált vízzel mostuk. A 35

A kaszpáz-3 kimutatásához a következő reagenseket használtuk: citrátpuffer: 0,01 M; pH 6,0 PBS: foszfáttal pufferolt sóoldat; Ca és Mg ionok nélkül; pH 7,4 BSA: szarvasmarha szérum albumin (ROTH 8076.2; tárolás 4 ° C-on) NSfS: normális juhszérum (DAKO X0503; tárolás 4 ° C-on) CNS: normál kecskeszérum (DAKO X0907; 4 ° C-on tárolás) nyulak -Serum: DAKO X0902; Tárolás 4 ° C-on DAB: 20 mg diaminobenzidin/100 ml PBS + 25 µl H2O2, 30%; pH 7,6 Felhasznált antitestek: RahCaspase-3: Serotec AHP476 (nyúl antitestje humán kaszpáz-3 ellen); 1: 100 PBS-ben + 2,5% CNS + 0,1% BSA (tárolás 4 ° C-on). GaR-Ig: DAKO Z0421 (kecske antitestjei nyúl immunglobulinjaival szemben); 1:20 PBS-ben + 1% BSA (tárolás 4 ° C-on) Nyúl-PAP: DAKO Z113; 1:40 PBS-ben + 1% BSA (tárolás 4 ° C-on)

Fény- és elektronmikroszkópos vizsgálat

A fénymikroszkópos vizsgálatokat a németországi Zeiss-től származó axioszkóp segítségével végeztük. A HE-vel festett szakaszok vizsgálatakor különös figyelmet fordítottak a villi alakjára, a kriptának menetére és az apoptózis előfordulásának jelzéseire. A PAS-AB (pH2,5) festett szakaszokat a serlegsejtek eloszlása és a mucin előforduló pH-értékei szempontjából értékeltük. A minták értékelése előtt, amelyeken a specifikus bizonyítékokat (proliferáció és apoptózis) elvégezték, először a pozitív vagy negatív kontrollok alkalmazásával ellenőrizték a módszer specificitását. Ezt követően különös figyelmet fordítottak a detektálandó szerkezetek előfordulására és elhelyezkedésére. A pásztázó elektronmikroszkóp vizsgálatot a kanadai Bausch & Lomb Nanolab 2000 típusú készülékén végezték. A transzelektron mikroszkópos minták kiértékelését a németországi Zeiss-től származó EM 10 CR eszközzel végeztük.

végül a kripta kerülete mm-enkénti szaporodások számában fejeződött ki. Ezenkívül a nyálkahártya egy bizonyos szakaszán belül az aktívan osztódó hámsejtek teljes mennyiségét kiszámítottuk úgy, hogy a relatív szaporodási sebességet megszoroztuk a kriptaképzés által okozott megfelelő nyálkahártya-felület megnövekedési faktorral. Az így kapott érték azt fejezi ki, hogy a lamina muscularis mucosae bizonyos hosszúságán belül hány szaporodás van jelen a kriptahámban. Végül kiszámolták a hám megújulási indexét. Erre a célra meghatároztuk az aktívan osztódó hámsejtek teljes mennyiségét a villi felület nagyságához viszonyítva. A megújulási index azt mutatja, hogy hány új hámsejt keletkezik a villus felületéhez viszonyítva [proliferáció/mm villi felület].

Minden paramétert meghatároztunk minden sertésnél és a bél mindhárom szakaszán. Egyes esetekben a vett minták használhatatlanok voltak. Az átlagértéket ugyanazon paraméter értékeiből alakították ki, amelyeket többször regisztráltunk minden állatra és szakaszra. Összefoglalva a hat sertést egy csoportban, meghatároztuk a számtani átlagot is. Az egyes paraméterek összehasonlítását a csoportok között kétfaktoros varianciaanalízissel végeztük. A szignifikancia szintje 0,05 volt. Az alomhatások figyelembevétele érdekében az "Alom" tényező beágyazódott a "Csoport" faktorba. Ezután Kolmogorov-Smirnov illeszkedési tesztet végeztünk a standardizált maradványokkal a normális eloszlás meglétének ellenőrzése céljából. Normál eloszlás feltételezhető minden paraméter esetében. A vékonybél egyes szakaszai közötti paraméterek közötti különbségek vizsgálatához először az összes sertés értékét átlagoltuk. Ezután t-tesztet végeztünk párosított mintákon, a szignifikancia szint szintén 0,05. Az elemzéseket az SPSS for Windows számítógépes programmal végeztük, 1999. 9.0.1.