Pentilenetetrazol által kiváltott Kindling Mouse modellprotokoll (németre fordítva)

Összegzés

Ez a protokoll leírja a pentilenetetetrazollal történő kémiai gyújtás módszerét, és bemutatja az epilepszia egérmodelljét. Ez a protokoll felhasználható a görcsrohamok iránti hajlam és az egerek epilepsziás rohamai utáni patogenezis vizsgálatára is.

Absztrakt

Bevezetés

Az epilepszia krónikus neurológiai rendellenesség, amelyet visszatérő rohamok jellemeznek, és az emberek körülbelül 1% -át érinti. Az epilepsziás betegek epileptogenezisének és görcsrohamainak kialakulásának alapmechanizmusait a klinikai vizsgálatok nem tudják teljesen tisztázni. Ezért megfelelő állatmodellre van szükség az epilepszia 1 kutatásához.

Az epilepszia számos állatmodelljét alkalmazták az epilepszia fiziológiájának tanulmányozására és az epilepsziaellenes gyógyszerek azonosítására 2, 3. E modellek között a farmakológiai rohamindukció az epilepszia patológiájának tanulmányozására alkalmazott állatmodell előállításának általános módszere 4. Ez a módszer olcsó és egyszerű. Az elektródák által közvetített megvilágítás szintén általánosan alkalmazott módszer, de az eljárás költsége magasabb, és a módszer megköveteli a műtéti és elektromos készségeket az ismétlődő rohamok kiváltásához 5.

A farmakológiai indukció szintén előnyös, mivel a rohamok időzítése és száma könnyen szabályozható. Spontán rohamokat mutató genetikai egérmodelleket is alkalmaznak az epilepszia vizsgálatában. Lehetetlen azonban megjósolni, hogy ezekben a genetikai modellekben mikor és milyen gyakorisággal fordulnak elő rohamok 6. Monitoring rendszerre van szükség a génmódosított egerek epilepsziás viselkedésének megfigyeléséhez 6.

A rohamokat gyakran a PTZ egyetlen szisztémás beadása váltja ki, és a gyógyulás nagyon gyors, 30 percen belül 4, 5. Ily módon a PTZ-ignite modellben a rohamok száma könnyebben szabályozható. Az EEG-monitorozás azonban azt mutatta, hogy a PTZ által közvetített roham után 12 órán át általános tüskék láthatók. Az állatoknak ezért előnyösen 24 órán át megfigyelés alatt kell maradniuk a tonikus vagy myoclonicus roham után 21 a gyulladásos mechanizmusok részletesebb elemzése érdekében.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

A tokiói Fővárosi Orvostudományi Intézet állatgondozási és felhasználási bizottsága jóváhagyott minden kísérleti eljárást. Szülés utáni 8-16 hetes egerek ajánlottak. Bármely beltenyésztési törzs elfogadható a kísérlet során. A C57BL/6 egerek jobban ellenállnak a PTZ-nek, míg a BALB/c és a svájci Albino egerek érzékenyebbek a PTZ-re. Ebben a vizsgálatban C57BL/6-ot használtunk. A PTZ iránti érzékenység az egér életkorától is függ. A fiatalabb egerekhez képest az idősebb egerek jobban ellenállnak a PTZ-35-nek. Az ehhez a módszerhez használt állatok száma változhat, de minden feltételhez minimum 6-10 állat szükséges.

1. Oldjunk fel 2 mg/ml PTZ-t steril 0,9% (m/V) NaCl-ban. Készítse elő a PTZ-t a használat napján.

1. Figyelje meg az állatok viselkedését és rögzítse az eredményeket.
   1. Osztályozza és lője le az epilepsziás viselkedést az alábbiak szerint: 38, 39 (1b. Ábra)):
      0: normális viselkedés, nincs rendellenesség.
      1: Immobilizáció, hasra fekve.
      2: Fejbiccentés, arc, mellső lábak vagy Megalosauridae myoclonia.
      3: Folyamatos egész testű myoclonus, myoclonicus rándulások, farok mereven tartott.
      4: gyermeknevelés, tónusos roham, oldalra esés.
      5: tónusos-klónikus roham, hátra esés, vadul rohanás és ugrás.
      6: halál.
2. Módosítsa a viselkedési kritériumokat a Racine Score 40 segítségével, a kísérleti körülményektől függően.

4. A rohamelemzés után

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A PTZ ismételt injektálása a rohamok súlyosságának növekedését idézi elő. Hat C57BL/6 egeret kezeltünk PTZ-vel, további 6 egeret sóoldattal kezeltünk kontrollcsoportként. A PTZ dózisa 35 mg/kg volt, és 10 injekciót adtak be. A roham pontszáma fokozatosan nőtt a PTZ injekciókkal, míg sóoldatokkal nem tapasztaltak görcsöket vagy rendellenes viselkedést (2. ábra)) okoztak. Az ANOVA, majd Bonferroni-teszt szignifikáns különbséget mutatott a PTZ-vel kezelt és a sóoldattal kezelt csoport között.

Az ismétlődő roham elősegíti az aberrált axonális ágképződést (mohás rostcsírát) és a szemcsés sejtek rendellenes vándorlását a hippocampusban. Az egereket 25 injekcióval kezeltük PTZ-vel (az adagot 24 mg/kg-ról 35 mg/kg-ra állítottuk be, hogy az egerekben súlyos görcsrohamok fennmaradjanak anélkül, hogy súlyos rohamok okoznának halált). Az egér agyát 3 héttel az utolsó injekció után rögzítettük. A kontrollagyakat a PTZ injekciók előtt rögzítettük. Az agyszeleteket immunszinezzük anti-synaptoporin (x 500) és anti-ZnT3 (x 500) antitestekkel a mohás rostcsírával szemben (3A. Ábra)) és anti-doublelecortin antitesttel (x 200) a granulátum sejtek rendellenes vándorlásának megfigyelésére (3A. ábra)). Mohás rost hajtott ki a szemcsés sejtrétegben PTZ-kezelt lemezeket rögzítettek (3A. Ábra). Az újszülött granuláris sejtek, amelyek immunreaktívak a duplekortinra, a hiluson belül helyezkedtek el a PTZ-vel kezelt szeletekben (3A. Ábra)) megfigyelt. A szemcsés sejtréteg és a hilus, a 3A. Ábrán látható a 3. ábra bLátható.

Vita

Itt bemutatunk egy általánosan elérhető protokollt az epilepszia farmakológiai állatmodelljének létrehozására. A PTZ által közvetített kémiai gyújtás nagy múltra tekint vissza, és széles körben elfogadott modell az epilepszia szövettani és sejtes patológiájának vizsgálatára 41. Az epilepszia kémiai Kindle modelljét korábban Suzdak és Jansen, 1995 42 vizsgálta. A farmakológiai rohamindukció, különösen a PTZ esetében, egyszerű és egyértelmű módszer súlyos rohamok kiváltására. Az injekciós dózis változása összefügg a roham súlyosságával. Ezért nagyon könnyű meghatározni a megfelelő dózist több vizsgálat során a PTZ-dózis és az ebből fakadó viselkedés megváltoztatásával.

Sok kutató megpróbálta modellezni a kopogós vagy bekopogós egereket, például az epilepsziát, és sikerült olyan egereket előállítani, amelyek spontán rohamokat szenvednek 43, 44. A farmakológiai rohamindukció azonban továbbra is jó modell az epilepsziában. A rohamok indukciójának másik elterjedt módszere, az úgynevezett genetikai módosítás magában foglalja az elektródák beültetését az állat agyába és az áramütés által közvetített rohamok kiváltását. Ez a módszer drága, nehéz és sebészeti készségeket igényel az elektróda pontos elhelyezéséhez az agyban 5.

A görcsrohamok kémiai kiváltása lehetővé teszi az epileptogenezis és az epilepsziaellenes gyógyszerek szűrésének gyors vizsgálatát alacsony költséggel, 2, 4. A spontán rohamok és az SE gyakorisága és súlyossága az alkalmazott gyógyszer függvényében változik. A kainsavat és a pilokarpint elsősorban SE és később krónikus spontán vagy visszatérő 45, 46, 47 rohamok kiváltására használják. Másrészt a PTZ-t mind az SE elősegítésére használják, amikor nagy dózisban fejlődik ki, mind pedig a kémiailag gyulladt állatokat, ha szubkonvulzív dózisban 48,49 adják. Ezenkívül ismertek a görcsrohamokat kiváltó görcsrohamok mechanizmusai. Például a roham mechanizmusának blokkolása segíthet az epilepszia elleni gyógyszerek azonosításában. Másrészt genetikai modellekre van szükség az epilepsziás rohamokat okozó mechanizmusok tanulmányozásához 50. A rohamokat okozó mechanizmusok tisztázása után meg lehet kezdeni az epilepszia elleni gyógyszerek szűrését.

Az itt bemutatott reprezentatív eredmények szerint az állatok viselkedését a PTZ beadása után 30 percig figyeltük meg. Azonban, amint azt a Protokoll szakasz említi, az állatok viselkedését előnyösen 24 órán keresztül vagy legalább 6-10 órán keresztül figyeljük meg a PTZ injekció után, különösen akkor, ha a rohamok pontja eléri a 3-at vagy annál magasabbat. Bár az állat egész napos megfigyeléséhez állat-felügyeleti rendszerre van szükség, az elhúzódó megfigyelés kritikus fontosságú az epilepszia mély megértéséhez. Ezenkívül a roham időtartama és a roham késleltetése hasznos módszer a begyűjtésre. Ezek a mérések akkor fontosak, ha a roham időtartama és késése megváltozik az idő és a roham súlyossága szempontjából.

Kémiailag táplált állatok roham utáni hisztopatológiáját tanulmányozták, különösen a hippocampusban. Ismétlődő rohamok vagy SE mohás rostcsírát (27, 28), az újszülött szemcsés neuronok 25, 29 kóros migrációját, asztrogliózist a hippocampusban 30 és piramis idegsejtek apoptózisát váltják ki 31, 32. ezek az agy szövettani változásai megzavarják az epilepsziás betegek neurológiai funkcióit. Például az epilepszia és az autizmus spektrum rendellenesség (ASD) és az értelmi fogyatékosság (ID) összefüggését 51, 52, 53 elismerik. Az, hogy az epilepsziás rohamok kiváltják-e az ASD-t, vagy az ASD és az ID okozzák-e az epilepsziás tüneteket, még mindig bonyolult kérdés. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a PTZ által közvetített rohamok ASD-szerű társadalmi-kognitív károsodást 54 és ID-szerű tanulási hiányokat 55, 56, 57 okoznak. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az epilepszia által közvetített hisztopatológia idegi diszfunkciókat és pszichiátriai rendellenességeket okoz.

Az epilepszia által előidézett szövettani változások a rohamok kiváltása után időbe telnek. A farmakológiai rohamindukció ebből a szempontból előnyös, mert a kutatók kontrollálni tudják az állatok rohamainak időzítését, számát és súlyosságát. A kémiai gyújtást is beleértve, az epileptogenezis állatmodelljei továbbra is vizsgálják az epilepszia indukciójának mechanizmusát és a kapcsolódó neurofiziológiai rendellenességeket.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerzők nem jelentenek be összeférhetetlenséget.

---