Sherbrooke Egyetem

Sherbrooke Université de Sherbrooke A P2X7 receptor glükóz és C/EBPa effektorai, valamint bélhámsejtjeinek szabályozása a By Maude Bilodeau Sejtbiológiai programban Értekezés az Orvostudományi és Egészségtudományi Kar számára, a Master of Science fokozat megszerzése céljából Sc.) A sejtbiológiában Sherbrooke, Quebec, Kanada * 2012. november 26. Az értékelő zsűri tagjai Prof. Femand-Pierre Gendron, Anatómiai és Sejtbiológiai Tanszék Prof. Claude Asselin, Anatómiai és Sejtbiológiai Tanszék Prof. Alfredo Menendez, Maude Bilodeau mikrobiológiai tanszék, 2013

sherbrooke

T a b a te rök TARTALOMJEGYZÉK. IV AZ ÁBRÁK LISTÁJA. VII. TÁBLÁZATOK FELSOROLÁSA. IX RÖVIDÍTÉSEK FELSOROLÁSA. X BEVEZETÉS. 2 1. L in t e s t in. 2 1.1 F o n c t io n és st r u c t u r e g e n e r a l e. 2 1.2 L a x c r y p t e v il l o s ity. 4 1.3 A b so r p t io n e t r é g u l a t io n by g l u c o s e. 7 2. Extracelluláris adenozin 5-trifoszfát. 11 3. Az eu rspur erg erg P 2 se ns ib les à L A T P. 13 3.1 Le re cept eu r P 2 X 7. 16 3.2 A P vevő 2 X 7. 18 4.0 L atranscr ip t io n. 19 4.1 Pr o c e k egy r e g u l a t io n. 19 5,0 A C/E B P. tényállása 2 0 5,1 C/E B P a. 2 0 5.1.1 Iso fo r m e s e t l o c a l is a t io n. 2 0 5.1.2 F o n c t io n. 21 5.1.3 M o d e d e g u l a t io n d o t e n t azaz l t r a n s c r ip t io n n e l. 21 5.2 C/E B P o. 2 2 5.2.1 Iso fo r m e s és l o c a l egy t io n. 22 5.2.2 Funkciók. 22 5.2.3 M o d e d e g u l a t io n d u p t e n t azaz l t r a n s c r ip t io n n e l. 23 HIPOTÉZIS. 25 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK. 26 1. M o d è l e s c e l l u l a ir e s. 26 1,1 C a c o - 2. 26 1,2 H E K 2 9 3 T. 26 1,3 IE C -6. 27 2. M o d è l e o u r is. 27 2.1 S o u r is C/E B P p in v a l idé e. 27 2.2 S o u r NOD. 27.

VI 4. A g l u c o se u r th e x p r e s s io n d e f a c t e u r s C/EBPa e t p d a n az IEC-6 SEJTEK hatása. 50 5. A g l u c o k hatása a C/EBPa e f a c c e e r p a k a CACO-2 sejtekben. 52 6. R ol o f C/EBPa ÉS P s u r l a t r a n s a c iw a t io n o f P2X7 p r o m o t e rs. 54 7. A C/EBPp a c t r a c t io n f a c t io n a u r p r o m o t P2X7-ben elemzése glükózstimulált KACO-2 sejtekben. 56 8. A C/EBPa és a LIP iso f o r m e pr e se k k hatása a C/EBPP-re a c t iv a t io n A P2X7 PROMOTORON. 59 9. D e r m a t io n o f th e c a p a c it e o f r e c e p t e u r P2X7-ben a C/EBPP ÁTÍRÁSI TÉNYEZŐJÉT MEGHATÁROZOTT SEJTAMODELBEN. 62 10. Im pactofin val id a t io nof C/EBPp express io n a savban a surl ex pr e ssio n OF P2X7, GLUT2 ÉS C/EB Pa. 64 11. Im pa ctdud ia b è tesurl 'express io ndufacteurdetran sc r ip t io n C/EBPp, P2X7 VEVŐ ÉS GLUT2 SZÁLLÍTÓ A NOD egérmodellben. Hiba! Meghatározatlan zászló i. VITA. 73 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS. 83 HIVATKOZÁSOK. 84.

1. táblázat: A Q-PCR elemzésekhez használt primerek. 29 2. táblázat: Az immunblotokhoz használt primer antitestek felsorolása. 31 3. táblázat: Az immunoblotokhoz használt másodlagos antitestek listája. 32 4. táblázat: A humán P2X7R promoter PCR-amplifikálásához használt primerek. 33 5. táblázat: A csonka humán P2X7R promoter PCR-amplifikálásához használt primerek. 36 6. táblázat: A P2X7 promoter felépítése. 39

L is tedesabr é v ia t io ns AC ADP DNS AMP c RNS ATP BzATP C/EBP ChIP CREB DAG ERK G-CSF GLUT IL IP3 LAP LIP MAPK NOD NF-kB oatp P300/CBP PKA PKB PKC PI3K PLC adenilát-cikláz-adenozin extracelluláris diposzfát-dezoxiribonukleinsav Ciklikus AMP ribonukleinsav-adenozin-5-trifoszfát-2,3 -o- (benzoil-4-benzoil) -atp CCAAT/enhancer-kötő fehérjék kromatin immunprecipitációs tábor-válasz-elem-kötő fehérje diacilglicerin Extracelluláris szignál-szabályozott kináz granulocita stimuláló faktor glükóztranszporterek interleukin inozitol 1,4,5-trifoszfát Májaktiváló fehérje Májgátló fehérje Mitogén-aktivált protein-kináz nem elhízott diabéteszes nukleáris faktor-kappa B adenozin-5-trifoszfát-peroxidát oxidált p300/CREB-kötő protein-protein-kináz A protein-kináz B-protein-kináz foszfoinozidid-3-kináz foszfolipáz C

XI Q-PCR kvantitatív polimeráz láncreakció Rb retinoblasztóma Ser szerin SGLT1 nátrium-glükóz transzporter 1 STAT jelátalakítók és transzkripció aktivátorok T IR receptor receptor 1 típusú TB P TATA doboz kötő fehérje Thr treonin TNF tumor nekrózis faktor WT vad típus

3 EMREZÉSI RENDSZER Epehólyag Q. Nyelőcső máj Duodenum Emelkedő vastagbél Bél gyomor hasnyálmirigy Keresztirányú vastagbél Leszálló vastagbél Sigmolde Rectum 1. ábra: Az emésztőrendszer. Az emésztőrendszer számos, ebben a diagramban bemutatott szervet tartalmaz, nevezetesen a szájat, a nyelőcsövet, a gyomrot, a májat, a hasnyálmirigyet, a vékonybelet, a vastagbelet és a végbélnyílást (módosítva: http://www.maalox.fr.). y * '.; -v. Végbélnyílás

5 az apikális membrán, a glycocalyx. Ezt a védőréteget a membránfehérjékben jelen lévő cukrok együttese alkotja. A glycocalyx véd a bél lumenében található enzimek és vegyi anyagok ellen (Becker et al., 2010). Másrészt, amint a 2. ábrán láthatjuk, számos más speciális sejttípus létezik, amelyek felelősek a szerv integritása szempontjából fontos különféle funkciókért (Alberts et al., 2008). Az enterociták mellett serlegsejteket találunk a villusban. Ezek a sejtek felelősek a nyálka szekréciójáért, amely távol tartja a bélflórát a hámtól, és keni a béltartalmat az étel mozgásának megkönnyítése érdekében (Cheng, 1974). Vannak olyan enteroendokrin sejtek is, amelyek nagyon nagy endokrin szervet alkotnak. Ezek felelősek részben a bél megfelelő működéséért és a más szervekkel, így a hasnyálmirigyért és a májért való kommunikációért (Roth és Gordon, 1990). 20 típusú enteroendokrin sejt létezik, amelyek különféle hormonok szekréciójára specializálódtak. Például az S-típusú sejtek túlnyomórészt a szekretint választják ki (Bloom és Fawcett, 1986).

6 Anjflbinoaafr pnumctcn <> (Scw # De "Cors *" 9 "E nwoendocnne Gobtet m" tuft Enterocyta M-Cells * AWI1 2. ábra: A különböző bélsejtek differenciálódási modellje. A bal oldali ábra a kriptavilla tengelyét mutatja valamint a különböző sejttípusok és a jobb oldali ábra a különböző jeleket képviselik, amelyek szabályozzák a belekben jelen lévő sejttípusok differenciálódását (Gerbe et al., 2011).

9 ALACSONY FÉNY ALACSONY ALKALMAZÁS ELŐTT Alacsony cukorkoncentráció FÉNY VÉR Nagy cukorkoncentráció o se VÉR 2 N a \, 2N kevés, glükóz 5 mm glükóz sok glükóz mako se _ az M étrend bazolaterális sok glükóz g 3. ábra: A bél glükóz felszívódásának mechanizmusa étkezés előtt és után. (A) Étkezés előtt az összes glükózt az SGLT1 transzporter szállítja az enterociták apikális membránjánál. A Glut2 transzporter bazolaterális szinten lokalizálódik, és lehetővé teszi a glükóz transzportját a vérből az enterocitákba, hogy fenntartsák energiakészletüket. (B) Étkezés után a Glut2 az intracelluláris vezikulákból gyorsan bejut az enterociták apikális membránjába, és a cukrok felszívódásának fő komponensévé válik. Basolaterális szinten a Glut2 lehetővé teszi a glükóz és a fruktóz kijutását a véráramba. (Módosítva: Kellett és Brot-Laroche, 2005).