A cisz-9, transz-11 konjugált linolsav gátolja a gyulladásos folyamatokat az asztma modellekben in vitro és in
1 FRIEDRICH-SCHILLER-UNIVERSITÄT JENA LEHRSTUHL TÁPLÁLÉSI FIZIOLÓGIA TÁPLÁLÓTUDOMÁNYI INTÉZETÉTŐL A cis-9, transz-11-konjugált linolsav gátolja a gyulladásos folyamatokat asztma modellekben in vitro és in vivo Jena Friedrich Schiller Egyetem Gyógyszerésztudományi Kar Anke Magdalena Jaudszus, Mechterstädt Jena, 2008
2 lektor: 1. Prof. Dr. Gerhard Jahreis 2. Prof. Dr. Stefan Lorkowski 3. Prof. Dr. Dr. Alfonso lámpák A vita időpontja: 2009. február 26
3 A szüleim Annemarie és Dietmar, valamint az összes gyermek a CLA vizsgálatban
4 TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések listája V Ábrák felsorolása VII. Táblázatok felsorolása IX 1 Bevezetés Bronchiás asztma meghatározása és epidemiológia Diagnózis Kórélettan Immunológiai alapok Allergiás szenzibilizáció Allergiás reakciók okai és kockázati tényezői Genetika Környezeti tényezők Fertőzések és higiéniai hipotézis A diéta hipotézise konjugált konjugált linol CLA szintézis Bakteriális kémiai élettani hatások Peroxisome proliferator által aktivált receptorok (PPAR) A PPAR család tagjai Szerkezet gén expresszió PPAR és légúti gyulladás ellenőrzése A CLA gyulladáscsökkentő hatást fejt ki a PPAR-okon keresztül Objektív hipotézis Speciális cél I. rész: Immunológia In vitro modell In vivo modell rész II: Anyagcsere Anyag és módszerek In vitro modell Sejtbiológiai módszerek Stimulánsok és inhibitorok Zsírsavak PPARγ antagonista GW lipopoliszacharid A Z elllinie BEAS-2B tenyésztés a BEAS-2B izolálás hosszú távú tárolási stimulálása és eozinofil áramlási citometria tisztítása a BEAS-2B és az eozinofil I.
7 TARTALOM 9.4 A c9, t11-cla beépítése a BEAS-2B-be 24 óra elteltével a t7, c9 és t8, c10-cla kimutatása a c9, t11-cla-csúcsban Kiegészített olaj: c9, t11-cla-gazdag triazilglicerin-kiegészített olaj: CLA-Mix Triazylglycerol Zsírsavak eloszlása olívaolajban gazdag étrend után Nyilatkozat Elismerés Kiadványok és kongresszusi hozzászólások CV IV
28 BEVEZETÉS (Chin et al. 1994). Mivel azonban a legtöbb vizsgálatot olyan izomer keverékekkel végeztük, amelyek c9, t11-cla és t10, c12-cla-t tartalmaznak körülbelül egyenlő részekben és kis mennyiségben más izomereket, a megfigyelt hatásokat nem lehetett egyértelműen hozzárendelni egyik vagy másik izomerhez. Az egyes izomerek reprezentációjának továbbfejlesztett szintézismódszerei most sokkal differenciáltabb betekintést engednek a c9, t11-cla és t10, c12-cla meglehetősen eltérő és néha ellentmondó hatásmódjaiba (2. és 3. táblázat). 16.
48 ANYAG ÉS MÓDSZER Detektálás: Enzimreagens: Szekunder antitest: biotinilezett anti-humán IL-8 mAb (G 265-8 klón, BD Pharmingen): 1 µg/ml blokkoló pufferben Avidin-HRP (BD Pharmingen) 1: 1000 blokkoló pufferben Szubsztrátreagens: TMB 1: 100 Gallati pufferben TMB: 240 mg 3,3,5,5 -TMB (Fluka, Neu-Ulm, D) 5 ml DMSO (Sigma) 5 ml etanol Gallati puffer: Citrát-puffer: stop Oldat: 0,034% H 2 O 2 (Merck) citrátpufferben 33,6 g citromsav-monohidrát 400 ml desztillált vízben. feloldjuk 4 N KOH-val, pH 3,95-re állítva desztillált vízzel. töltsük fel 500 ml-re 1 M H 3 PO 4 (minden Merck) ELISA-t az ECP számszerűsítésére Az ECP kimutatására szolgáló ELISA-t egy kereskedelemben kapható készlet (MBL, MoBiTec, Göttingen, D) felhasználásával hajtottuk végre a gyártó ajánlása szerint. A készletben található 96 mikrohullámú lemez már be volt vonva, és az oldatok használatra készek voltak, vagy az utasításoknak megfelelően készültek. A kit kimutatási határa 0,125 ng/ml volt. 36
49 ANYAG ÉS MÓDSZER In vivo modell A női BALB/c-t Harlan Winkelmann-tól (Borchen, D) szereztük be, és 6-8 hetesek voltak, amikor felvették őket. Valamennyi kísérletet a Berlini Munkahelyi Biztonsági, Egészségvédelmi és Műszaki Biztonsági Hivatal (LAGetSi) hagyta jóvá egy meglévő állatkísérleti alkalmazás kiterjesztéseként (Reg G 0247/03) a német állatjóléti törvény szerint. 3.4 A C9, t11-CLA-ban gazdag triazil-glicerin (C9, t11-CLA-ban gazdag) táplálékkiegészítők (6. táblázat, 13. ábra) a metil-ricinolát () átalakításának módszerével () és a CLA-Mix preparátummal (6. táblázat, 13. ábra) Pórsáfrányolaj alapján előállított linolsav báziskatalizált izomerizációja (mind Cognis, Illertissen, D). 6. táblázat: A CLA-készítmények zsírsav-összetétele. GC elemzés. Zsírsav [% FSME] c9, T11-tiszta TAG CLA keverék TAG C14: 0 0 0 C16: 0 0,2 2,6 C18: 0 0,5 2,8 C18: 1c9 1,8 14,4 C18: 1c11 0,3 0,7 C18: 2n6 3,1 0,3 C18: 3n3 0,2 0 C20: 0 0,1 0 C20: 1 0,5 0 C20: 5n3 0,4 0 CLA 86,6 78,0 Egyéb 6,7 1,4 Rövidítések: TBE zsírsav-metil-észter, TAG-triazil-glicerin 37
50 ANYAG ÉS MÓDSZER A c9, t11-cla dús B NAP CLA mix NAP 1,4% 0,3% 0,4% 22,1% c9, t11-cla 0,1% 0,4% c11, t13 -cla t10, c12-cla c9, c11-cla t9, t11-cla 45,0% 52,6% 74,9% 13. ábra: A CLA-készítmények izomereloszlása. V: c9, t11-cla-gazdag TAG. B: CLA-Mix NAP. Megjelenik a teljes CLA százalékos aránya. HPLC-analízis (9.5.) Táplálási rendszer A tartási körülményekhez való 5 napos alkalmazkodás után (22 ° C, 12 órás fény/sötét ciklus, max. 5 állat/ketrec az IVC polcrendszerben) az állatokat véletlenszerűen a vizsgálati csoportokba soroltuk. A próba-étrendek a ssniff (Soest, D) V1535 fenntartó étrendjén alapultak, és különleges megrendelések voltak, amelyeket a megfelelő olajokkal dúsítottak (7. táblázat). 7. táblázat: A teszt-étrend zsírsav-összetétele [g/kg]. Alapvető takarmány-ellenőrzés Elsődleges megelőzési ellenőrzés Másodlagos megelőzés c9, t11- CLA CLA-Mix zsírsav Olaj hozzáadása 1,5% napraforgóolaj d, 3% olívaolaj d, 5% napraforgóolaj 1,5% c9, t11-tiszta TAG C14: 0 0,1 0, 1 0,1 0,1 0,1 0,1 C16: 0 4,7 5,6 5,0 5,6 4,7 5,1 C18: 0 0,8 1,4 1,2 1,4 0,9 1,2 C18: 1c9 6,2 10,0 16,1 10,0 6,5 7,7 C18: 2n6 18,0 27,8 18,8 27,8 18,4 18,3 c9, t11-cla, 9 5.0 c9, c11-cla, 9 0.1 t10, c12-cla, 9 C18: 3n3 2.3 2.5 2.4 2.5 2.5 2.3 C20: 0 0, 1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 C20: 1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 C20: 4n egyéb 0,3 0,3 0, 3 0,3 0,7 0,3 0,3 1,3% CLA-Mix 38. NAP
56 ANYAG ÉS MÓDSZEREK 9. táblázat: A PPARγ amplifikálásához használt primerek és próbák. FW 5 -TAA CTG CCG GAT CCA CAA A-3 PPARγ primer RV 5 -ATC TCC GCC AAC AGC TTC T-3 szonda 5 fam-ctg TCG GTT TCA GAA GTG CCT TGC-3 tam primer FW 5 -GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC A-3 ß-aktin primer RV 5 -GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA-3 szonda 5 vic-cca TGT ACG TAG CCA TCC AGG CTG TG-3 tam 10 µl templát (100 ng) 40 Az optimalizált reakcióelegyből µl-t pipettázunk (8. táblázat), és három példányban elemezzük optikai 96-lyukú lemezeken (ABgene, Epsom, UK) a valós idejű PCR-rendszerben (Applied Biosystems) a következő hőmérsékleti program segítségével: 10. táblázat: Hőmérsékleti program az amplifikációhoz a PPARγ. Hőmérséklet [C] időciklusok min perc s 60 1 perc 40 Az LA-4 sejtekből kivont összes RNS hígítási sorozatát belefoglaltuk belső standardként minden egyes menetbe. Fehérje biokémiai módszerek ELISA az IL-5 meghatározásához a BAL-ban. ELISA elvégzése: Az oldatok összetétele: Bevonat: Elsődleges antitest: Anti-egér IL-5 mAb (TRFK5 klón, BD Pharmingen): 2 µg/ml bevonó pufferben Bevonó puffer: 8,4 g NaHCO 3, 1 l desztillált vízben . oldjuk fel, állítsuk pH = 8,2-re 10 N NaOH mosópufferrel: 0,05% Tween 20 PBS 44-ben
62 ANYAG ÉS MÓDSZEREK ANOVA). Mivel ennél a paraméternél csak a diéták fő hatásait lehetett értelmezni, a csoportok közötti különbségeket nem párosított Student s T-tesztekkel határoztuk meg. A P enh görbéket ANOVA alkalmazásával értékeltük ismételt mérésekhez. A c9, t11-cla OVA csoportok összehasonlítását GW9662-vel és anélkül, valamint a másodlagos prevenciós megközelítés adatait és a zsírsavak szöveti koncentrációit egyváltozós varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük. A diéták hatását a vizsgált szervek zsírsav-összetételére korrelációs elemzéssel értékeltük. A szignifikancia küszöbét 5% -os hiba valószínűséggel határoztuk meg (p 0,05). 50