A kicsi, nem kódoló RNS-ek a Streptococcus kétkomponensű rendszerének CiaRH regulonjában
A kicsi, nem kódoló RNS-ek a kétkomponensű rendszer CiaRH regulonjában Streptococcus pneumoniae-ban Doktori értekezés: Dipl.-Biol. A Kaiserslauterni Műszaki Egyetem Biológiai Tanszéke jóváhagyta a természettudományok doktora fokozat megszerzéséért. Kovács Márta a doktori bizottság elnöke: Prof. Dr. Matthias Hahn 1. riporter: Prof. Dr. Regine Hakenbeck 2. riporter: Prof. Dr. John A. Cullum A tudományos megbeszélés dátuma: 2009. május 8. Kaiserslautern
Jelen munkát a Kaiserslauterni Műszaki Egyetem Biológiai Tanszékének mikrobiológiai tanszékén végezték Prof. Dr. irányításával. Regine Hakenbeck készítette.
Megerősítem, Kovács Márta, hogy én magam készítettem a jelen munkát. Biztosíthatom Önöket, hogy csak a megjelölt forrásokat és forrásokat használtam fel. Kaiserslautern, 2009. március 17
Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék Oldal Tartalom-jegyzék 1 Összefoglalás 5 Rövidítések 7 1. Bevezetés 8 1.1 Streptococcus pneumoniae 8 1.2 A Streptococcus pneumoniae genetikai kompetenciája és lízise 10 1.3 A kétkomponensű CiaRH 13 1.4 Kis, nem kódoló RNS-ek 16 1.5 A munka célja 22 2. Anyag 23 2.1 Baktériumtörzsek 23 2.2 Plasmidok 25 2.3 Oligonukleotidok 26 2.4 Tenyésztő táptalaj 31 2.4.1 A CpH8 táptalaj 31 2.4.2 A THB táptalaj 32 2.4.3 D véragar 32 2.4.4 Az LB táptalaj 33 2.4.5 A 2xTY táptalaj 33 2.5 Felhasznált antibiotikumok 34 3. Módszerek 35 3.1 Mikrobiológiai módszerek 35 3.1.1 A baktériumok növekedésének dokumentálása 35 3.1.2 A tenyésztés körülményei 35 3.1.3 A törzs megőrzése 36 3.1.4 Mikroszkópia 36 3.1.5 Streptococcus pneumoniae transzformációja 36 3.1.6 A Streptococcus kompetencia tesztelése . pneumoniae 37 3.1.7. Escherichia coli transzformációja 37 1
Tartalom 4.10 Az egyes csrnák hatásának vizsgálata a comc 144 fordítására a csrnák és a célgének mrnáival 153 5.5 Kapcsolat a CiaRH-hoz társuló fenotípusok 156 és a csrnas között 5.6 Hasonló hatások és mechanizmusok más organizmusokban 163 5.7 Kitekintés 165 6. Irodalomjegyzék 167 4
1. Úgy tűnik, hogy a bevezetés részt vesz az extracelluláris adhezinek és a szekretált virulencia faktorok szabályozásában (Kreikemeyer et al., 2001). Egy másik szabályozó RNS a pel lokusz, amelyet egy transzpozon könyvtár elemzésével fedeztek fel, és az exoproteinek expressziójára kifejtett pleiotrop hatása miatt volt észrevehető. Az RNS génje 459 bp hosszú, egy további gén, a saga a 147-308 bp pozíciók között van kódolva. Kimutatható volt azonban, hogy a nem transzlált RNS és nem a transzlált SagA termék befolyásolja a virulencia faktorok expresszióját (Mangold et al., 2004). A harmadik ismert kis RNS a RivX. Úgy tűnik, hogy ez az RNS a rivrx transzkriptum feldolgozási terméke. Bár a transzkriptumon itt is van ORF, sikerült megmutatni, hogy az RNS-nek és nem a fehérjének van szabályozó hatása a szabályozott génekre. Ez az RNS pozitív hatást vált ki az Mga-szabályozott génekre, amelyek a virulencia fontos szabályozói (Roberts és Scott, 2007). 21.
2. 2.4. Anyag Tenyésztő táptalaj 2.4.1 CpH8 táptalaj (C táptalaj) a Streptococcus pneumoniae tenyésztéséhez Az ebben a munkában végzett összes vizsgálat során a Streptococcus pneumoniae törzseket CpH8 táptalajon növesztettük (Lacks & Hotchkiss, 1960). Ennek a táptalajnak az egyes komponenseit külön-külön állították elő, és csak szükség esetén pipettázták össze. Az egyes komponenseket fény kizárásával 4 ° C-on tároltuk. 2.17. Táblázat: A CpH8 tápközeg összetétele Komponens mennyiség [ml] PreC 400 13. kiegészítés Glutamin [1 mg/ml] 10 Adams III 10 piruvát 2% 5 foszfátpuffer 15 Élesztő kivonat 5% 9 Végső térfogat 462 2.18. Táblázat: Az egyes komponensek összetétele Komponens További mennyiség PreC Na-acetát, vízmentes 1,2 g kaszaminsav 5 g L-triptofán 5 mg L-cisztein 50 mg H 2 O 1000 ml-es kiegészítéssel állítsa be a pH-t 7,5, autokláv 3in1 sók 60 ml 20% (w/v) glükóz 120 ml szacharóz 50% (w/v) 6 ml adenozin [2 mg/ml] 120 ml uridin [2 mg/ml] 120 ml autokláv komponensek külön-külön, steril körülmények között pipettázzunk együtt Adams III Adams I 160 ml Adams II 40 ml aszparagin 2 g kolin-klorid 0, 2 g CaCl2 [0,1 M] 1,6 ml víz és 1000 ml steril szűrés, és könnyű foszfátpuffer nélkül tárolandó ph8 KH 2 PO 4 [1 M] 53 ml K 2 HPO 4 [1 M] 947 ml autokláv 31
2. 3in1 sók Adams I Adams II MgCl 2 x6h 2 O 100 g CaCl 2, vízmentes 0,5 g MnSO 4 x4h 2 O [0,1 M] 0,2 ml H 2 O és 1000 ml autoklávozó Biotin 0, 5 g nikotinsav 150 mg piridoxin HCl 175 mg kalcium-pantotenát 600 mg tiamin-HCl 160 mg riboflavin 70 mg H 2 O 1000 ml steril szűrőn és könnyű FeSO 4 x7h 2 O 500 mg CuSO 4 x5h 2 O 500 mg ZnSO 4-en tárolva x7h 2 O 500 mg MnCl 2 x4h 2 O 200 mg HCl koncentrált H 2 O 10 ml és 1000 ml steril szűrés, és fénytől elzárva tárolandó. 2.4.2 Todd-Hewitt táptalaj (THB) A Todd-Hewitt táptalaj egy komplex táptalaj, amelyet gyakran használnak pneumococcusok kezelésére, és használatra készen állítják elő (Difco, Detroit, USA). A táptalajt a gyártó utasításainak megfelelően készítettük el és autoklávoztuk. 2.19. Táblázat: A Todd-Hewitt táptalaj összetétele A szarvasmarha szív mennyisége (friss szövet infúziója) 3,1 g pepton 20 g glükóz 2 g NaCl 2 g nátrium-karbonát 2,5 g dinátrium-foszfát 0,4 g 2,4,3 D véragar Szilárd tápközegként Streptococcus pneumoniae tenyészetet alkalmaztunk D véragarral. Ebből a célból a D-agart autoklávozták, és 48 ° C-ra történő lehűlés után defibrinált juhvért (Oxoid) adtak hozzá 3% (v/v) végkoncentrációig. Bármilyen adalékanyag, például antibiotikumok hozzáadása után az elegyet összekeverjük és steril Petri-csészékbe öntjük. 32
2. Anyagtáblázat 2.20: A D véragar komponens glükóz baktopepton neopepton élesztő kivonat összetétele NaCl Tris agar H 2 O mennyiség 1 g 10 g 5 g 1,25 g 5 g 1,25 g 15 g - 1000 ml 2,4,4 LB táptalaj Lauria-Bertani (LB) táptalajt alkalmaztunk az E. coli tenyésztésére (Sambrook et al., 1989). Az LB agar előállításához 15 g/l agart adtunk a táptalajhoz. Szükség szerint megfelelő antibiotikumokat és egyéb adalékokat adtak hozzá. 2.21. Táblázat: Az LB táptalaj összetétele Komponens Mennyiség baktopepton 10 g NaCl 5 g élesztő kivonat 5 g H20 és 1000 ml 2,4,5 2xTY táptalaj A 2xTY táptalajt kisebb mennyiségű plazmid izolálásához használtuk E. coli-ból. 2.22. Táblázat: A TY táptalaj összetétele Komponens mennyisége Baktopepton 16 g NaCl 5 g élesztő kivonat 5 g H2O - 1000 ml 33
2. Anyag 2.5 Felhasznált antibiotikumok A 2.23. Táblázatban összefoglalt antibiotikumokat szükség szerint hozzáadtuk a szilárd és folyékony közeghez. Előkészítésük után a törzsoldatokat sterilen szűrtük és -20 ° C-on tároltuk. 2.23. Táblázat: Felhasznált antibiotikumok Antibiotikum oldószer A törzsoldat koncentrációja Tetraciklin 50% EtOH 3 mg/ml 3 µg/ml Végső koncentráció Ampicillin H 2 O 20 mg/ml 100 µg/ml Spektinomicin H 2 O 20 mg/ml 80 µg/ml Streptomycin H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml eritromicin 90% EtOH 1 mg/ml 1 µg/ml kanamicin H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml kloramfenikol H 2 O 1 mg/ml 1 µg/ml 34
4. Eredmények 1,0 Transzformációs hatékonyság% 0,8 0,6 0,4 0,2 R6 RK12345 RK123 RK45 R6 ciar: aad9 0,0 0 20 40 60 80 100 120 Sejtsűrűség [NU] 4.24. Ábra: Különböző ccn transzformációs hatékonysága deléciós törzsek a vad típusú S. pneumoniae R6 és S. pneumoniae R6 ciar: aad9. A sejtsűrűség nephelo egységekben az X tengelyen látható. A transzformáció hatékonysága százalékban (a transzformált sejtek aránya az élő csíraszámban) az Y tengelyre esik. A vad típusú R6 fekete, az RK12345 piros, az RK123 zöld, az RK45 sötétkék és az S. pneumoniae R6 ciar: aad9 világoskék színnel látható. Az RK12345, RK123 és RK45 törzsek természetes transzformálhatóságának vizsgálati eredményei összefüggést jeleznek a kicsi, nem kódoló RNS-ek és az S. pneumoniae R6 természetes transzformálhatósága között. Mindhárom vizsgált törzs csökkent transzformálhatóságot mutatott. Ez a fenotípus R6 ciar: aad9 esetén nem volt megfigyelhető. Csak a kompetenciacsúcs elmozdulását lehetett meghatározni az alacsonyabb sejtsűrűség irányában. Az RK12345 törzs transzformálhatóságának nyolcszoros csökkenése ellentmond a törzs törölt ciarral történő teljes transzformálhatóságának. 105
4. Eredmények 4.7.3 A célgén ß-galaktozidáz aktivitásának meghatározása - LacZ fúziós fehérjék a csrnas függvényében A cél gén - lacz fúziós fehérjék aktivitását a csrnas függvényében ß-galaktozidáz vizsgálatokkal határoztuk meg. Erre a célra a plazmidokat inszertáltuk a vad típusú S. pneumoniae R6 és a csrna mutáns S. pneumoniae RK12345 genomjába. A β-galaktozidáz aktivitást a megfelelő törzsek teljes sejtlizátumaival mértük. A méréseket a középső exponenciális fázisban, Nephelo 80 sejtsűrűség mellett, és röviddel az állófázisba lépés után hajtották végre. A mérések eredményeit a 4.30. Ábra mutatja. R6 RK12345 20 T3comA 50 40 T3hsdS ß-Gal egységek 15 10 5 ß-Gal egységek 30 20 10 0 0 exp. Fázis stat. Fázis exp. Fázis stat. Fázis ß-Gal egységek 80 60 40 20 T3spr1610 ß-Gal egységek 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 T3comC 1000 0 exp. Fázis stat. 0. fázis exp. Fázis stat. Fázis 800 700 600 T3spr0081 8000 7000 6000 T3cibB ß-Gal egységek 500 400 300 ß-Gal egységek 5000 4000 3000 200 2000 100 1000 0 exp. Fázis stat. 0. fázis exp. Fázis stat. 125. szakasz
4. Eredmények 700 600 T3spr0231 200 180 160 T3blpY ß-Gal egység 500 400 300 200 100 ß-Gal egység 140 120 100 80 60 40 20 0 exp. Fázis stat. 0. fázis exp. Fázis stat. Fázis ß-Gal egységek 400 350 300 250 250 200 150 T3spr0822 ß-Gal egységek 50 40 30 20 T3spr1932 100 50 10 0 0 exp. Fázis stat. Fázis exp. Fázis stat. 20. fázis T3spr0265 80 T3spr1645 15 60 ß-Gal egységek 10 ß-Gal egységek 40 5 20 0 exp. Fázis stat. 0. fázis exp. Fázis stat. 1000. fázis 800 PvegT ß-Gal egységek 600 400 R6 RK12345 200 0 exp. Fázis stat. Fázis 4.30. Ábra: A 12 klónozott célgén - lacz fúziós fehérje β-galaktozidáz aktivitása a vad típusú S. pneumoniae R6 és S. pneumoniae RK12345 típusokban. A méréseket két időpontban hajtottuk végre: az exponenciális fázisban Nephelo 80 sejtsűrűséggel és röviddel az álló fázisba lépés után. Az egységeket úgy definiáljuk, mint nmol felszabadult ONP/perc/mg fehérje. Legalább 2 független kísérlet átlagát mutatjuk be. A célgén-lacz fúziós fehérjék aktivitása a C táptalajban fekete színnel, S. pneumoniae R6 esetén, piros színnel az S. pneumoniae RK12345 esetében látható. Kontrollként a P vegt promoter aktivitását mindkét törzsben meghatároztuk. 126.
4. Eredmények 4.39. Ábra: A comc-rna és a csrna3 interakciós komplexeinek sáveltolódási vizsgálata és Northern blot elemzése. A fenti képeken a SYBRGreenII festett sávváltó gélek láthatók. A gél betöltése a korábban leírtak szerint történik. Az interakciós sávokat piros nyilak jelölik. Az alábbi képek a foltos géleket mutatják. A bal oldali képen a csrna3-ra specifikus próbát használtunk a detektáláshoz. A jobb oldali képen a membránt levágták és comcbzw. használt htra-specifikus próbák. A törölt interakciós sávokat piros nyilak jelölik. Interakciós vizsgálat spr0081-gyel Az interakciós vizsgálatokat mind az 5 csrna-val elvégeztük. A csrna2, a csrna3, a csrna4 és a csrna5 között egyértelmű interakciós sávok detektálhatók. Ugyanakkor ezeken a pályákon megfigyelhető volt az spr0081-rna tényleges járási magasságban való eltűnése. A csrna1-ben nem láthattunk egyértelmű interakciós sávokat, és az spr0081 sáv sem változott. Így a spr0081-rna nem képzett kölcsönhatási komplexet a csrna1-gyel. Itt is a csrna1 körülbelül kétszer olyan magas sávokat képezett (4.40. Ábra, 5. sáv). Ezeket a sávokat a negatív kontroll utolsó nyomaiban is láthattuk. 142
5. Megbeszélés 5. Megbeszélés 5.1 A CiaRH által szabályozott intergenikus promóterek és azok átiratai: A csrnas A CiaRH által szabályozott intergenikus promóterek erősen függnek a CiaR-től. Működő válaszszabályozó nélkül gyakorlatilag nincs expresszió (Halfmann et al., 2007). E promóterek aktivitását az 5.1. Táblázat mutatja. 5.1. Táblázat: A CiaRH által szabályozott intergenikus promóterekből származó β-galaktozidáz aktivitások. Promoterek R6 ciar: aad9 R6 (wt) R6 ciaht230p P ccnc