A Tomoauto A protokoll használata nagy áteresztőképességű automatizált krioelektron tomográfiai protokollhoz

Összegzés

Bemutatunk egy protokollt arról, hogyan lehet nagy átbocsátású krio-elektron tomográfiával meghatározni a molekuláris gépek nagy felbontású in situ struktúráit. A protokoll lehetővé teszi nagy mennyiségű adat feldolgozását, elkerüli a gyakori szűk keresztmetszeteket és csökkenti az erőforrások leállását, lehetővé téve a felhasználó számára, hogy fontos biológiai kérdésekre koncentráljon.

Bevezetés

A III-típusú szekréciós rendszerek (T3SS) elengedhetetlen virulencia-meghatározók számos Gram-negatív kórokozó esetében. Az injekció, más néven tűkomplexum, az a központi SST3 gép, amely szükséges az effektor fehérjék közvetlen transzlokációjához a baktériumokból az 1, 2 eukarióta gazdasejtekbe. Az injektiszóma egy extracelluláris tűből, egy alaptestből és egy citoplazmatikus komplexből áll. tri komplex néven is ismert. Korábbi tanulmányok tisztázták a Salmonella és a Shigella tisztított injekcióinak 3-D szerkezetét, valamint a fő bazális testfehérjék 4, 5 atomszerkezetét. A Salmonella, Shigella, és Yersiniát a cryo-ET 6, 7 fedte fel. Az effektor- és tűszerelvény kiválasztásához elengedhetetlen citoplazmatikus komplexet azonban ezekben a struktúrákban nem tették láthatóvá.

Ezt a nagy áteresztőképességű krio-ET csővezetéket használták az S. flexneri minicellák intakt injekcióinak vizualizálására. Összesen 1917 tomogramot állítottak elő ezzel a módszerrel, feltárva az intakt gép in situ szerkezetének nagy felbontását, beleértve a citoplazmatikus válogató platformot, amelyet a 19-es átlagos tomogram határoz meg. A vad típusú és mutáns gépek molekuláris modellezésével magas az áteresztő csővezeték új utat kínál az intakt injektiszóma szerkezetének és működésének megértéséhez a natív sejtkörnyezetben.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Minicella előkészítés

2. EM rács előkészítése

3. High Flow Tilt sorozatú automatizált gyűjtemény

  1. Alacsony nagyítási tervek gyűjteménye
    1. Nyisson meg egy új Navigator ablakot a SerialEM 10 "Navigator" menüjében a "Megnyitás" gombra kattintva (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM).
    2. Keressen olyan rácssejteket, amelyek elfogadható képalkotási körülményeket tartalmaznak (pl. Vékony jég, nincs szennyeződés, érdeklődés tárgya) az alacsony nagyítású fluoreszkáló képernyő használatával (

    4. Nagy sebességű, automatizált Tilt sorozatú kezelés és rekonstrukció a Tomoauto használatával

    5. Átlagos sub-tomogram

    MEGJEGYZÉS: A közepes szubtomográfiai kísérletek feldolgozásához az i3 15 csomagot használjuk (http://www.electrontomography.org/), de a leírt protokoll általában a legtöbb rendelkezésre álló sub-Tomogram szub-tomográfiai folyamatkísérletre vonatkozik. szoftvercsomagok16to, azonban a leírt protokoll általában a legtöbb 16-18 átlagoló szoftveres szub-tomogramra elérhető.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Reprezentatív eredmények

    A S. flexneri mini-sejtmintákat összegyűjtöttük és az ábrán látható módon feldolgoztuk biztos a sematikus ábra 1, használatával a következő részletes tomoauto csővezeték biztos az alak 2. A Tilt-sorozatokat a SerialEM 10 segítségével gyűjtötték össze, amely lehetővé teszi a nagy áteresztőképességű tilt-soros felvételt a felhasználó által kijelölt pontokon, kis nagyítású felszállókon. (ábra 3). A mikrográfiákat dózisfrakcionálási üzemmódban gyűjtöttük egy közvetlen érzékelő kamerán a sugár által kiváltott mozgás csökkentése érdekében (4. ábra). Tomoauto úgy koordinálja a mozgáskorrekciót, hogy mikroszkópos fényképeket készít a MOTIONCORR 22 kezelés megosztott adagjairól, és az eredményeket egy későbbi feldolgozásra szánt sorozatba állítja. (1. film).

    áteresztőképességű
    1. ábra A nagy áteresztőképességű krioelektron tomográfia sematikus áttekintése. A folyékony szuszpenziót gyorsan lefagyasztják egy EM rácson, és a tilt-sorozatokat automatizált számítógéppel vezérelt elektronmikroszkóppal gyűjtik össze. A kapott mikrográfokat a tomoauto segítségével automatikusan feldolgozzuk a tomográfia előállításához. Az utolsó lépés egy szegmentált S. flexneri minicella egy tomográfiából, amelyet Hu és mtsai. 2,015 15. Az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez kattintson ide.


    2. ábra A tomoauto folyamat folyamatábrája. A tomoauto áramlás lebontása megmutatja, hogy az adatok miként dolgoznak fel osztott dózisú mikroszkópos fényképek gyűjteményéből egészen egy átlagos végső szub-tomográfiáig. Az alfolyamat szimbólumok részletezik azokat a feladatokat, amelyeket a tomoauto a megfelelő konfigurált szoftver futtatásával koordinál a bemenet feldolgozásához. A kimeneti adatok szimbólumai általában azt mutatják, hogy a felhasználó nem használja, míg a dokumentumok és a többszimbólumos dokumentumok a felhasználó által ténylegesen manipulált kimenetet jelzik. Végül a kijelzõ szimbólumok azt mutatják, hogy hol történik a felhasználói beavatkozás a munkafolyamatban. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.