Akut agyi trauma egerekben, amelyet hosszanti kétfotonos képalkotási protokoll követ (fordítva
Összegzés
Az akut agyi trauma olyan súlyos sérülés, amelyet a mai napig nem kaptak megfelelő kezelést. A multifoton mikroszkóp lehetővé teszi az akut agyi trauma kialakulásának hosszanti vizsgálatát és a rágcsálók terápiás stratégiáinak vizsgálatát. Az akut agyi trauma két modelljét, amelyet in vivo kétfoton agyi képalkotással vizsgáltak, bemutatja ez a protokoll.
Absztrakt
Bevezetés
Az akut agykárosodás jelentős közegészségügyi probléma, mivel a balesetek, elesések vagy rablások során a sérülések gyakorisága magas, és a krónikus következményi fogyatékosság nagy gyakorisággal fordul elő. Az agyi sérülések kezelésének terápiás megközelítései továbbra is teljesen tüneti jellegűek, korlátozva ezzel a preklinikai, műtéti és kritikus ellátás hatékonyságát. Ez különösen súlyosvá teszi az agykárosodás társadalmi és gazdasági következményeit. Különböző okokból a legtöbb klinikai vizsgálat új terápiás megközelítések alkalmazásával nem mutatta be az agykárosodás utáni gyógyulás javulását.
Az állatmodellek kritikus jelentőségűek az új terápiás stratégiák kidolgozása szempontjából abban a szakaszban, amelyben az agysérült betegeknél a gyógyszer hatékonyságát jósolják. Jelenleg számos bevált állatmodell létezik a fejsérülések között, beleértve az egyik kontrollált kortikális ütést, a folyadék ütéses sérülését 2, a dinamikus kortikális deformációt 3, a súlycsökkenést 4 és a fotósérüléseket. Számos kísérleti modellt alkalmaztak a fejsérüléssel összefüggő patológia bizonyos morfológiai, molekuláris és viselkedési aspektusainak tanulmányozására. Azonban egyetlen állatmodell sem teljes mértékben sikeres az új terápiás stratégiák érvényesítésében. Az összetett kóros folyamatok értékeléséhez megbízható, reprodukálható és kontrollált agysérüléses állatmodellek kidolgozása szükséges.
Itt javasoljuk a fecskendő tűvel történő sztereotaktikus szúrás módszerének tanulmányozását, amely kombinálható a helyi gyógyszerek egyidejű alkalmazásával, a helyi agykárosodás fejlett modelljeként, valamint eszközként az akut trauma patofiziológiai következményeinek tanulmányozására az emlős agyában in vivo.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Az itt bemutatott összes eljárást az állatgondozásra vonatkozó helyi irányelvek szerint hajtották végre (A finn állatkísérletekről szóló törvény 62/2006). Állatengedélyt (ESAVI/2857/04.10.03/2012) a helyi hatóságtól kaptak (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). 1-3 hónapos felnőtt, 24-38 g súlyú egereket az igazolt egyetemi állattartó létesítményben egyedi ketrecekben tartottak, és ad libitum étellel és vízzel látták el.
1. Agykárosodás képalkotása egy agyablakon keresztül
2. Agykárosodás képalkotása a soványított koponyán keresztül
Készítsen 0,5–1,5 mm átmérőt. Fúrás közben sűrített levegővel távolítsa el a csontdarabokat. A súrlódási túlmelegedés elkerülése érdekében a vékonyítási eljárás során szakaszosan végezze el a fúrást. Hűtsük le a fúrót az oldattal szobahőmérsékleten, és rendszeresen tegyünk puffert a hígított területre a hő felvétele érdekében.
MEGJEGYZÉS: A kéreg károsodásának elkerülése érdekében ne fúrjon nagy területeket (> 1,5 mm), kivéve egy vékony réteget (előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosainak.
Reprezentatív eredmények
1) krónikus agyablak és 2) koponyavékonyodás, poszt-traumás agyi képalkotáshoz transzgenikus egerekben: Két operációs folyamatot optimalizáltunk. A vizsgálati termékek sematikus ábrázolása 1. ábra Látható. Traumatikus szúrás egy 0,3 mm külső átmérőjű (30 G) acél tűn keresztül a fúrókútnál (1A. Ábra) szomorú. A koponyaablak sikeres előkészítése lehetővé teszi a képalkotást 650 µm mélységig a pia felszíne alatt (1B. Ábra), míg a koponya elvékonyodásának határa általában körülbelül 300 µm (1C) a 3D rekonstrukcióhoz hasonlóan alkalmazzon Thy1-YFP-biztos H egér kérgi piramissejteket.
A szúró trauma a dendritek kiküszöbölését és a kapilláris hálózatok megsemmisítését eredményezi az agykéreg ellenőrzött térfogatában. Az első két nap során az elváltozás területe megnövekedett, a trauma indukálta a dendritikus hólyagosodást és a dendrites retraction bULBS kialakulását a perilesion területeken, amint azt in vivo multifoton mikroszkóppal jeleztük. (2. ábra) megfigyelt.
Közvetlenül a sérülés után elvégeztük a koponya Forst kép aktiválását és a mikroglia CX3CR1-EGFP egerek migrációját (3A. Ábra). Az SHG képalkotás értékes eszközt kínál a sérülés helyének meghatározásához (3B) behatárolni. Az SHG-jeleket előidéző extracelluláris mátrixmolekulák erősen dúsulnak az agy parenchymájában a szúrás traumájánál. Mindenekelőtt finom mikro folyamatokat hívnak meg, majd a mikroglia sejtek a sérülés helyének határáig vándorolnak (3A. Ábra).
A vékony üvegpipetta bevezetése és a festék leadása által okozott lehetséges sérülések felmérése érdekében in vivo kétfoton mikroszkópos kísérleteket végzünk sulforhodamine 101 mikroinjekcióval Thy1-YFP-H egerekben agyi trauma nélkül. Ban ben 4. ábra A bemutatott ábrák a mikroinjekció helyét mutatják be 3 órával az injekció beadása után. Az agyhártyába történő pipetta behelyezésének nyoma az SHG által (4A) vizualizált felismerni. Asztrociták sulforhodamine 101 injekcióval (4B. Ábra) bevezetve megjelölt. A Dendrites YFP nem fejezi ki a sérülés morfológiai jeleit, például hólyagosodást vagy villanykörték törését a Thy1 promoter alatt (4. ábra C) bemutatni.
4. ábra Az injekciós oldattal végzett szöveti terhelés vizsgálata üveg mikropipettán keresztül. A. Egy nyom (szaggatott vonallal ábrázolva) az agyhártyák SHG vizualizálásában 3 órával az injekció beadása után. B. Az injekcióval bevezetett szulforhodaminnal jelölt asztrociták. C. A dendritek az YFP-t expresszálják a Thy1 promoterek alatt. D. Kombinált kép A. (SHG - szürke), B. (Asztrociták - piros), C. (idegi dendritek - sárga).
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Az agytrauma hirtelen, kiszámíthatatlan esemény. Itt írjuk le azt az állatmodellt, amely emberi spektrumban reprodukálja a vér spektrumát olyan agykárosodások után, mint a neurodegeneráció, a dendritek kiküszöbölése, agyödéma, glia hegek, fokális subarachnoidális vérzéssel járó vérzések az agykéregben és a megfigyelt kóros változások fokozott permeabilitása. -Agygát. A primer és szekunder patogenezis, valamint a trauma utáni gyógyulás vizsgálata érdekében ezt a sérülési modellt kombinálták a finom idegi és glia struktúrák longitudinális in vivo vizualizációjával. Transzgénikus egérvonalakat alkalmaztunk, amelyek a fluoreszcens mikroglia (CX3CR1-EGFP) 9 fehérjét expresszálják neuronokban (Thy1-YFP-H) 7, asztrocitákban (GFAP-EGFP) 8 vagy. Ezenkívül a második harmonikus generációs (SHG) képalkotást és az asztrocita betöltést is alkalmaztuk Sulfarhodamine 101 10-vel.
Az itt leírt modell összefoglalja az agykárosodás penetrációs típusát. Ezért a jelen modell korlátozása az, hogy nem nyújt információt a zárt fejsérülés mechanizmusairól. Nemrégiben Schwert és társszerzői többfoton képalkotási eredményekről számoltak be a sejtek viselkedéséről a perikontuszionális kéregben 6. Figyelembe véve, hogy a zárt fejsérülés gyakori orvosi eset, a szerzők által közölt módszertani megközelítés nagyon ígéretes a hagyományos kutatási módszerek számára az agyi hatások területén. Trauma 11 kiegészítés.
A krónikus 12 koponyaablakot és a 13 koponyahígító készítményeket egyaránt alkalmaztuk a sejtek viselkedésének tanulmányozására poszt-traumás körülmények között, élő agyban. Mindkét módszer bizonyos előnyökkel és korlátokkal rendelkezik. Így a krónikus agyablak jobb felbontást, az agyszövetbe való behatolás javított optikai mélységét és több képalkotó egység kényelmét biztosítja. Ezzel szemben kevésbé valószínű, hogy gyulladást vált ki a koponya elvékonyodásának képalkotó helyén, és ami még fontosabb, lehetővé teszi a gyógyszerek és színezékek ismételt alkalmazását. Az ilyen típusú kísérletekben alkalmazandó farmakológiai szerek néhány példája Asztal 1 meghatározott.
1. táblázat: Farmakológiai szerek és injekciós festékek kortikális táncos sérülési modellben.
A fiziológiai és kóros körülmények között nagyon fontos biokémiai események széles skálája kémiai inhibitorokkal, fluoreszcens indikátorokkal és vírusszerkezetek útján bevezetett mutált fehérjével vizsgálható. A koponyavékonyodás előkészítésével meghatározott időablakok megválasztásának előnyei nagyon relevánsak lehetnek ezekhez a vizsgálatokhoz.
Jelen tanulmányban a második harmonikus jelet generáltuk a sérülés helyének elhatárolására. Alternatív megoldásként a sérülés helyének határait gyengén szóródó fluoreszcens festékkel, például nagy molekulatömegű dextrán fluoreszcens konjugátummal (2 millió dalton) lehet jelezni.
A közelmúltban Schaffer és munkatársai (14) krónikus gyártási újranyitó ablakot használtak koponyával a fluoreszcens festékek újraküldésére az egér kérgén. Valószínű, hogy a koponyaablak újbóli megnyitása hátrányosan befolyásolhatja az agyszövet átlátszóságát. Ezenkívül nehéz megjósolni az újrafelvétel okozta gyulladás időbeli lefolyását, amely befolyásolhatja a kötőszövet újranövekedését.
A soványított koponya gyártásának fő előnye, hogy terápiás vegyületeket (és más anyagokat igényel, amelyek helyi injekciót igényelnek az agyszövetbe) többször is be lehet juttatni a trauma előrehaladása során, anélkül, hogy bonyolítaná a műtermékeket (pl. Agyi ablak folytatása nélkül).
Azokban az esetekben, amelyek nem igényelnek közvetlen hozzáférést a sérült területhez, javasoljuk, hogy a koponya elvékonyodott területét hígítsuk egy üveg fedőlappal, amint azt Kleinfeld és munkatársai a papírban és acélban leírják a csiszolt koponya előkészítésénél. a következő opcionális eljárásokat. Tegyen egy kis csepp agarózt (1,5%) a elvékonyodott koponyarégióra, várja meg, amíg gélesedik, távolítsa el a felesleges agarózt, ezért csak hagyja a sérülés helyén. Az agaróznak meg kell védenie a sérülés helyét a külső behatásoktól. Szárítsa meg a vékonyított fej tetejét sűrített levegővel. Hagyjon kis mennyiségű poliakril ragasztót a # 0 fedőlap kis darabján, és tegye a vékonyított koponyarészre. A ragasztó megakadályozza a poliakril csont és a kötőszövet újranövekedését, és így az elvékonyított koponyát az ablak alatt tartja.
Ezeknek az eljárásoknak a kombinációja lehetővé teszi az akut és krónikus poszttraumás folyamatok tanulmányozását, és a gyógyszereket helyileg vagy szisztémásan és közvetlenül a kezelési hatások nyomon követésével biztosítja. A kettős vagy hármas transzgénikus egérvonalak, a parti seinderek, szintén hasznosak lehetnek több poszttraumás folyamat, például gliasejt-hegesedés és idegi ág újraszaporodásának egyidejű megjelenítésére. Arra számítunk, hogy az akut agykárosodási modellek intravitális kétfoton mikroszkóppal megvizsgáltuk, hogy eredményesnek bizonyuljon a jelölt gyógyszer tesztelésében.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzőknek nincs mit elárulniuk.
Köszönetnyilvánítás
Mélységesen hálásak vagyunk, hogy dr. Frank Kirchhoff GFAP-EGFP és CX3CR1-EGFP egér törzsek biztosításáért. A munkát a Finn Nemzetközi Mobilitási Központ, a Tekes, a Finn Idegtudományi Doktori Iskola (FGSN) és a Finn Akadémia támogatásával támogatták.