Emberi ex vivo ateroszklerotikus plakkmodell a sérülésbiológiai protokoll tanulmányozásához (németre fordítva)

Összegzés

Az ateroszklerózis krónikus gyulladásos folyamat. Ez a kézirat egy könnyen használható ex vivo modellt szemléltet a friss carotis vagy koszorúér plakkok vizsgálatára. Az ex vivo modell lehetővé teszi az emberi arterioszklerotikus elváltozások gyulladásos környezetében előforduló lehetséges anyagok vizsgálatát, és az eredmények különféle módszerekkel vizsgálhatók.

Absztrakt

Bevezetés

Az érelmeszesedés mint krónikus gyulladásos betegség az egyik vezető halálok az ipari országokban 1/2. Az ateroszklerózis szövődményei, különösen az akut koszorúér-szindróma, a sérülékeny elváltozások felszakadásához kapcsolódnak, ami aterotrombózishoz és vaszkuláris elzáródáshoz vezet. 3. A veleszületett és szerzett immunitás látszólag részt vesz a 2,4-5 atherogenezis minden lépésében. Bár jelentős előrelépés történt a szívroham kezelésében, az érelmeszesedés és a kardiovaszkuláris mellékhatások hatékony megelőzése még mindig megoldatlan. Tehát a lézióbiológia tanulmányozása fontos az érelmeszesedés patofiziológiájával kapcsolatos ismereteink bővítéséhez, valamint az új terápiás célpontok azonosításához és új terápiák kidolgozásához.

Sok esetben rágcsáló modelleket alkalmaznak specifikus betegségek patofiziológiájának tanulmányozására. Az aterogenezis egérmodellekkel történő tanulmányozását azonban számos korlátozás kíséri: (1) Az ateroszklerotikus egerek általában magas koleszterinszintű étrendet kapnak. Ezekben a modellekben a koleszterinszint nem hasonlítható össze azoknál a betegeknél, akiknél a szérum koleszterinszintje megemelkedett 6. (2) Jelentős különbségek vannak az egér és az emberi immunrendszer között; így a Foxp3 specifikus marker az egér szabályozó T-sejtjeihez, míg az emberi Foxp3 expresszió az emberi T-sejtekben nem feltétlenül ad szabályozó fenotípust. Szintén a Th1/Th2 paradigma, mint az embereknél, nincs meghatározva az egér T-sejtjeire. Teljesen átvihető cellák. (3) Olyan markerek készlete, amelyeket egér monociták és makrofágok azonosítására használnak, mint például az F4/80, valamint a klasszikus (M1) és alternatív (M2) aktivációs minták markerei, amelyek nincsenek jelen az emberi mieloid sejtekben 8. (4) A rágcsáló és az emberi monociták perifériás vérben történő expresszióját alapvetőnek találták 9.

Ezért, hogy jobban megértsük az emberi érelmeszesedés krónikus gyulladásos folyamatait, ki kell használnunk az emberi szövetekkel, vérrel vagy sejtekkel végzett munka modelljeit. Itt leírjuk az emberi plakk szöveti tenyésztés modelljét, amely lehetővé teszi a lehetséges új anyagok vizsgálatát az emberi gyulladásos elváltozásbiológia koncepciójában.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Készítsen táptalajt az alábbiak szerint

Táptalaj: RPMI táptalaj.
Legyen 10% borjúmagzati szérum (FCS).
100 E/ml penicillin G-vel és 100 g/ml sztreptomicinnel.

2. Használatig tárolja a friss lepedékhengereket

Jelentős carotis stenosisban szenvedő ischaemiás tünetekkel vagy anélkül (stroke, átmeneti ischaemiás roham) szenvedő betegek carotis endarterectomiás műveletét érsebészek, szívkoszorúér-endarterectomiát szívsebészek koszorúér bypass műtétei során végzik. A carotis/koszorúér-plakkokat csoportosan el kell távolítani a plakkszerkezet megőrzése érdekében, a fentiek szerint 5.
A lepedék felszámolása után a mintát egy közepesen töltött csőbe helyezzük, és felhasználásig jégen tároljuk (a lepedéket teljesen közeggel kell lefedni).

4. A plakk szövetdarabok betakarításának meghatározott ideje után

A plakkdarabok sokkfagyasztása az mRNS izolálásához és a cDNS szintéziséhez (a részletes információkat lásd a proto-col 5. szakaszában).
A felülúszót és -20 ° C-on tároltuk az ELISA-analízishez.
Western-blot, összetör és lízis plakk szövet. Szűrje le a lizátumot egy 0,65 µm és 0,1 µm centrifugális szűrő eszközön.
Az immunhisztokémiai festéshez be kell ágyazni a plakkszövetet szövet-tec-be vagy paraffinba.

5. RNS-extrahálás tenyésztett lepedékdarabokból

Használjon TissueLysert a homogenizáláshoz.
Izoláljuk az RNS-t a készlettel (lásd: Anyagtáblázat) a gyártó utasításainak megfelelően.
Spektrofotométer segítségével határozzuk meg a mintákban az RNS mennyiségét és minőségét.
Használja a Boehringer cDNS készletet a reverz átíráshoz a gyártó utasításainak megfelelően.
Kvantitatív PCR-hez használjon például a Roche valós idejű PCR készletet SYBR Green-tel.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Először kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval (qRT-PCR) mutatjuk be az időtől függő változásokat a nem stimulált tenyésztett ateroszklerotikus elváltozások gyulladásos vegyületében. (1. ábra) elemzik. A plakkművelés során megfigyelhető a gyulladásos léziós miliő aktivitásának növekedése. 3 óra elteltével nem találtunk különbséget tenyésztés nélkül (az adatokat nem mutatjuk be). 8 órás plakk-tenyésztés után néhány molekula, például az IL-6, csak a TNF-a és az IFN-g csekély mértékű újraszabályozását tapasztaltuk, míg 24 óra elteltével különböző molekulák, például a TNF a, az IL-6 és az IFN- G. Figyelemre méltó, hogy minél hosszabb a plakk tenyésztési idő, annál nagyobb a variáció a molekuláris expresszióban.

Másodszor, annak bemutatása érdekében, hogy az ateroszklerotikus elváltozásokban a gyulladásos környezet befolyásolható-e, 1 µg/ml LPS-t tartalmazó plakk darabok eredményeit mutatjuk be 3 órán át, qRT-PCR-rel mérve (2. ábra) inkubáltuk. A stimulálatlan plakkdarabok negatív kontrollként szolgáltak. Megállapítottuk, hogy az LPS jelentősen megnövelte a gyulladásos vegyület aktivációjának mértékét az érelmeszesedéses elváltozásokon belül. Különböző citokinek (IL-6, TNF-a, stb.)., 2A-B ábra), Kemokinek (CCL2 stb., Nem látható), adhézió (ICAM-1, nem látható), lepedék destabilizáló (mátrix metallopeptidáz 9 (MMP9), nem látható) és protrombotikus molekulák (von Willebrand faktor, 2C, A szöveti faktort nem mutatjuk) LPS inkubációval szabályoztuk.

Harmadszor, a fehérje mennyiségének értékeléséhez a tenyésztett elváltozások szintjét ELISA-val elemeztük, és a lepedőszöveteket megszakítottuk Western blot segítségével. (3D ábra). Ban ben 3A-C az IFN-g, MCP-1 és TNF-a ELISA-analízisét mutatjuk be a tenyésztett minták felülúszójában, amelyeket LPS-sel vagy kontrollal inkubáltunk 8 órán át. A (foszforilezett) Western-blot analízis mellett az ERK 1/2 széttört és plakk szövetek lizálódtak, vagy LPS-stimulált kontrollal, és 3D ábra Látható.

Vita

Itt bemutatunk egy ex vivo plakk tenyésztési modellt, hogy megvizsgáljuk a potenciálisan releváns anyagok hatását az érelmeszesedéses elváltozások biológiájára. Ezen ex vivo módszerek fő előnye az említett anyagok gyulladásos sejtekre gyakorolt hatásának, valamint a sejt- és gyulladásos útvonalak, valamint a kaszkádok közötti kölcsönhatásoknak az emberi érelmeszesedéses elváltozásokban történő értékelésének lehetősége. Számos hasznos módszer (pl. RT-PCR, Western blot, immunhisztokémia, áramlási citometria, ELISA) segít átfogó elemzés elkészítésében a szóban forgó anyag hatásáról az érelmeszesedéses elváltozás gyulladására.

Az egér ateroszklerózisában fellépő gyulladásos folyamatok jól ismertek, a túlzott mértékű expresszió vagy bizonyos érdekes gének hiányának egérmodelljeinek köszönhetően is. Az eredmények azonban nem mindig felelnek meg szorosan az emberek 6-9,13-nak. Az ateroszklerotikus egerek általában magas patológiás cholEsterol diétát kapnak 6. Emellett ismert, hogy az emberek és az egerek közötti immunrendszer jelentős különbségeket mutat 9.7. Itt bemutatunk egy ex vivo plakk tenyésztési modellt, amely lehetővé teszi egy érdekes anyagnak a gátló vegyületre gyakorolt hatásának tanulmányozását emberi érelmeszesedéses elváltozásokban, Niessner és mtsai. 14 látható. Ezenkívül különféle további módszerek felhasználhatók az egér vizsgálatokkal összehasonlítható plakktenyésztési kísérlet eredményeinek elemzésére. Ezért az ex vivo modell bizonyos esetekben megnyitja az egér in vivo vizsgálatok helyettesítésének lehetőségét, és kiváló módszert jelenthet az egérrendszerben feltételezett ateroszklerózist elősegítő molekula és az emberi biológiai transzláció közötti rés áthidalására.

Az atherosclerosis ex vivo humán modellje nem hasonlítható össze az in vitro sejtkísérletekkel. A sejtvonalak könnyen tárolhatók és tenyészthetők, de fenotípusilag és funkcionálisan nem azonosak az elsődleges sejtekkel. A friss sejtek rendszeres vérvétel útján nyerhetők, de néha nehéz tenyészteni, és a tenyészetet számos tényező befolyásolja. Ezenkívül in vitro sejttenyésztési kísérletek segítségével nem lehet tanulmányozni a specifikus molekulák hatását a gátló vegyületre ateroszklerotikus elváltozásokban. Tehát az in vitro kísérletek fontosak az emberi biológiai vizsgálatok kezdeti (transzlációs) lépésében, de nem azért, hogy tovább elemezzük az érdeklődő molekula szerepét az emberi érelmeszesedés fogalmában, különös tekintettel a sejtek kölcsönhatására, valamint a gyulladásos kaszkádokra és az utakra gyakorolt hatásra. érelmeszesedéses elváltozások .

Monaco és mtsai. Létrehozta az emberi érelmeszesedéses szövetekből izolált sejtek fontos rövid távú tenyésztési rendszerét 15. Kollagenáz, elasztáz és DNáz enzimes keverékét használtad. Ez a módszer lehetővé teszi a léziós sejt-sejt kísérletek, a szignálpálya-elemzés és az adenovírus-vektorokkal végzett génátviteli vizsgálatok vizsgálatát. De továbbra sem ismert, hogy az enzimkeverék hogyan befolyásolja a sejteket, azaz az aktiváció mértékét, a felületi marker expresszióját stb. Továbbá kérdéses, hogy e kísérletek eredményei tükrözik-e az érelmeszesedéses elváltozások valódi folyamatait. Ezen túlmenően, a sejtek eredeti helyzete enzimatikus keveréssel megsemmisül, és a rövid távú tenyésztési rendszer ugyanazokkal a korlátokkal rendelkezik, mint az in vitro sejtkísérletek esetében.

Az ateroszklerotikus elváltozáson belüli specifikus sejt- vagy sejtpopulációs vizsgálatokhoz lehetőség van a lézeres befogási mikrodisszekciós módszer alkalmazására. Az érdekes sejtet vagy sejtvegyületet infravörös vagy UV lézer segítségével kivágják a szövetből, és RNS, DNS vagy fehérje elemzést végezhetünk. Úgy tűnik, hogy a lézeres befogással végzett mikrodisszekció nem károsítja a sejteket, a sejtfelszíni receptor expresszióját stb. De nem lehet tovább értékelni a sejteket, mint az in vitro vizsgálatok.

Az ex vivo modell endarterectomia mintákon alapszik. Különböző egyedektől kapott ateroszklerotikus plakkok használata nagyobb fokú differenciálsejt-összetételt eredményezhet, és ezért nagyobb eltéréseket okozhat a gének/fehérjék szintjén. Ezért fontos a nem fibroszklerotikus elváltozások 10 lipidben gazdag vagy bonyolult plakkminta használata, mivel a gyulladásos válasz lényegesen alacsonyabb a fibrosclerotikus elváltozásoknál. Ezért nagyon érdekes, hogy a plakk-tenyésztési kísérletek eredményeinek elemzése előtt értékeljük a lepedék morfológiáját.

Ezenkívül minden egyes minta az ateroszklerotikus elváltozás kialakulásának/progressziójának különböző szakaszait tartalmazza a kezdeti endotheliális diszfunkciótól és a lipidfelhalmozódás lépésétől a zsírcsíkokig és egy nekrotikus mag kialakulásáig a plakkok repedéséig. Ezért a plakk szövetek heterogenitásának minimalizálása érdekében le kell vágni azokat a margókat, amelyek általában az aterogenezis korai lépéseit jelentik.

Nem zárható ki, hogy a vágás szöveti sérülési reakciókat váltott ki. De plakkszövet-tenyésztési kísérleteink összehasonlítható gén expressziót mutattak a tenyésztett szövet plakk és a nem tenyésztett szövet plakk között. Tehát ez aláhúzza, hogy a jelenlegi módszer jó eszköz az érelmeszesedéses elváltozások gyulladásos környezetének tanulmányozására.

A KulturPlaque darabok legfeljebb egy napos időszakra korlátozódnak. Ha a plakkszövetet egy napnál hosszabb ideig tenyésztik, az eredmények változása drámaian megnő. Ezenkívül 3 nap elteltével a lepedék összetétele és morfológiája összeomlik.

Vannak korlátok, amelyeket szem előtt kell tartani a modell alkalmazása során. Az ex vivo modell jó módszer a gyulladásos környezet vizsgálatára ateroszklerotikus elváltozásokban. Ennek ellenére fontos összetevők hiányoznak ebben az összefüggésben. Nincsenek hemodinamikai tulajdonságok, és a szisztémás hatások teljesen hiányoznak. Továbbá ezzel a módszerrel csak rövid távú változások tanulmányozása lehetséges, de a plakkok morfológiájának lebontása miatt hiányzik a hosszú távú elemzés.

Összegzésképpen itt bemutatunk egy olyan módszert, amely hasznos lehet azoknak a kutatóknak, akik potenciális új molekulák tanulmányozását keresik az emberi érelmeszesedéses elváltozások gyulladásán. Az ex vivo plakk tenyésztési modell nem szenved különbségekben az egér és az emberi immunrendszer között, de lehetőséget ad arra, hogy elemezzük a sejtek kölcsönhatását az érelmeszesedéses elváltozások összefüggésében, és lehetőséget teremtsünk a helyi gyulladásos kaszkádok és elváltozási utak vizsgálatára. Az itt leírt ex vivo lepedék tenyésztési módszer könnyen használható és reprodukálható, és segíthet az új betegségmechanizmusok és terápiás célok azonosításában és validálásában.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerzőknek nem kell közölniük konfliktusokat.