Kétdimenziós gélelektroforézis protokoll (németre fordítva)
Áttekintés
A kétdimenziós gélelektroforézis (2DGE) olyan technika, amely több ezer biomolekulát képes feloldani egy keverékből. Ez a technika két különböző elválasztási módszert foglal magában, összekapcsolva: izoelektromos fókuszálás (IEF) és nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE). Ez fizikailag elválasztja a vegyületeket a gél két tengelyén izoelektromos pontjaik (elektrokémiai tulajdonságuk) és molekulatömegük alapján.
A videóban szereplő eljárás a 2DGE kulcsfogalmait és egy komplex fehérjeoldat összetételének jellemzésére szolgáló általános eljárást fedi le. Ennek a technikának három példáját mutatjuk be az alkalmazások rovatában, beleértve a betegség megindulásához és progressziójához szükséges biomarkerek detektálását, a betegek kontroll kezelését és a fehérjék tanulmányozását a transzláció utáni módosítás (PTM) után.
A kétdimenziós vagy 2D-s gélelektroforézis olyan technika, amely két különböző elválasztási módszer alkalmazásával több ezer fehérjét képes elválasztani egyetlen keveréktől. Az egyik technika, az SDS-PAGE vagy a nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis, nem különíti el teljesen a komplex anyagkeverékeket. A 2D gélelektroforézis párosítja az SDS-PAGE-t egy második módszerrel, az izoelektromos fókuszálással vagy az IEF-mel, amely elválik az izoelektromos pontokon, lehetővé téve a sejtben lévő összes fehérje oldódását. Ez a videó bemutatja a 2D gélelektroforézis alapelveit, egy általános eljárást és annak néhány orvosbiológiai alkalmazását.
A 2D gélelektroforézis első dimenziója az IEF. Minden fehérjének van egy pH-értéke, az úgynevezett izoelektromos pont vagy pI, ahol a nettó töltés nulla. Amikor egy fehérje elektromos mezőnek van kitéve, ellentétes töltéssel halad az elektróda felé. Az érdeklődésre számot tartó minták az immobilizált pH-gradiensek vagy az IPG, amfolitákkal töltött csíkok, amelyek savas és bázikus csoportokkal rendelkező molekulákat temettek el. Ezután elektromos teret viszünk a pH-gradiens csíkra, aminek következtében a fehérjék addig vándorolnak, amíg el nem érik a pH-t, és ezzel elérték a pI értéket, ahol elveszítik nettó töltésüket.
A második dimenzió futtatása előtt a beágyazott fehérjéket SDS-sel kezeljük, denaturálva őket, és egyenletes negatív töltést biztosítva. Miután elkészült, az IPG csíkokat poliakrilamid gélre helyezzük. Az alkalmazott elektromos mező a fehérjéket az anód felé húzza, a nagyobb fehérjék lassan mozognak a gélen.
Miután a fehérje-keveréket elkülönítettük pI és molekulatömeg szerint, a proteomtérképet foltokkal vizualizálták, és azonosították a kívánt fehérjéket.
Most, hogy megvitattuk a 2D gélelektroforézis elveit, nézzünk át egy tipikus laboratóriumi eljárást.
A kísérlet elvégzése előtt a fehérjéket táptalajban kell oldani. A minta szolubilizálását úgy végezzük, hogy a fehérjéket deotegráljuk kaotrop szerek kombinációjával a hidrogénkötés kölcsönhatásainak, a nemionos detergenseknek a megszakítására, a fehérjetöltet megváltoztatásának megakadályozására, a redukálószerekre, a diszulfidkötések és pufferek megszakítására. A zavaró bőséges fehérjék és más molekulák eltávolítása érdekében az anyagot centrifugálással és a kapott pelletből összegyűjtve egymás után extrahálják; amelyet endonukleázzal kezelnek, egy enzimmel, amelyet azért használnak, hogy ne fogyasszák a kísérletet zavaró DNS-t.
A fehérjék oldódása után IPG-csíkokat készítünk úgy, hogy egy csíkotisztító oldattal leöblítjük és fejjel lefelé száradni hagyjuk. Ezután minden csíkhoz hozzárendelnek egy szalagtartó számot. Miután elkészült, a csíkot lassú, csúszó mozdulattal terhelik a sejtkivonat negatív és pozitív pólusa között. Rehidratálás céljából nedves blotpapírt helyeznek az elektródára és a gélcsíkok alá; az IPG csíkokat ezután az IEF műszerre szegélyezzük. Nagy elektromos áram kerül alkalmazásra, és a fehérjék vándorolni kezdenek.
Az első dimenzió befejezése után a gél öntött eszközben készen áll az SDS-PAGE használatára. Az IPG csíkokat úgy kezeljük, hogy az SDS-t tartalmazó egyensúlyi pufferbe helyezzük őket. Az elektroforézis egység elektroforézis puffer hozzáadásával készül. A kezelt IPG-csíkokat csipesszel összegyűjtjük, a géllemezekre helyezzük és agarózzáró oldattal lezárjuk. Ezután egy feszültségforrás olyan elektromos teret alkalmaz, amely addig tart, amíg a leggyorsabban mozgó fehérjék 1 cm-rel a gél feneke felett vannak.
Az elektroforézis befejezése után a fehérjéket vizualizálni kell. Hagyományosan ez Coomassie kék vagy ezüst-nitrát színezésével történik. A kívánt fehérjéket Western-blot-analízissel átvisszük a gélről és elemezzük.
A második azonosítási megközelítés magában foglalja a fehérjék kivágását a gélből, emésztésüket, amikor tömegspektrometriával elemzik őket.
Most, hogy áttekintettünk egy módszert, vegyük fontolóra a 2D gélelektroforézis néhány alkalmazását.
Ennek a technikának az egyik leggyakoribb felhasználása a betegség iniciálásában és progressziójában részt vevő molekulák azonosítása. A 2D gélelektroforézis, tömegspektrometriával párosítva, felismeri a specifikus fehérjék fel vagy le szabályozását a beteg területeken az egészségesekhez képest.
Ezenkívül a 2D gélelektroforézis hasznos lehet a páciens előrehaladását követően egy lehetséges terápiás gyógyszerre adott válaszként. Mintákat lehet venni a betegektől a kezelés után különböző időpontokban. Ily módon a 2D gélelektroforézis, Western blot vagy tömegspektrometriás elemzéssel párosítva, képes kimutatni a negatív reakciókhoz, például a gyulladáshoz kapcsolódó fehérjéket; vagy a fehérjék hiánya edzett állapotban.
A 2D gélelektroforézis másik alkalmazási területe a fehérje szerkezetének és működésének vizsgálata poszttranszlációs módosítás vagy PTM után, amelyek adalékok a fehérjékhez, amelyek az mRNS-ből történő transzlációjuk után következnek be. A PTM különféle funkciókat végezhet, beleértve a fehérjeszignalizációt, a génexpresszió szabályozását vagy oxidatív károsodást. A 2D gélelektroforézis érzékeny az olyan változásokra, mint a metilezés vagy az acetilezés, amelyek elmozdulást okozhatnak a pI és a molekulatömegben.
Megnézte a JoVE 2D gélelektroforézisről készített videóját. Ez a videó leírta a technika elveit, egy tipikus kísérleti eljárást és néhány alkalmazását az orvosbiológiai területen.