Kiméra egerek generálása mutációkkal a CD22 és
Kiméra egerek generálása mutációkkal a CD22 jelátviteli tartományában és a CD22 funkciójának vizsgálata knockout egerekben Dolgozat értekezés a Würzburgi Bajor Julius Maximilians Würzburgi Egyetem tudományos doktori fokozatának megszerzéséhez, Claus-Peter Danzer, Mannheim-Neckarau Würzburg, 2002
Beküldve: A doktori bizottság tagjai: Elnök: Lektor: Dr. rer. nat. habil. Lars Nitschke lektor: Prof. Dr. rer. nat. Gert Pflugfelder A doktori kollokvium napja: Doktori bizonyítvány kiállítva:
Magyarázat: Ezúton kijelentem, hogy a kiméra egerek generálása mutációkkal a CD22 jelátviteli tartományában és a CD22 funkciójának vizsgálata kiütéses egerekben című disszertációt írtam, és hogy az általam jelzetteken kívül nem használtam semmilyen eszközt vagy forrást. Kijelentem továbbá, hogy ezt a szakdolgozatot semmilyen más vizsgáztatási eljárásban nem nyújtották be, sem azonos, sem más formában. A felvételi kérelemmel dokumentált diplomákon kívül korábban nem szereztem és nem is próbáltam megszerezni további tudományos fokozatot. Würzburg, a Claus-Peter Danzer
Ezt a munkát 1998. január 15-től 2002. január 31-ig végezték a Würzburgi Bajor Julius Maximilians Egyetem Virológiai és Immunobiológiai Intézetében dr. rer. nat. habil. Lars Nitschke készítette.
IV 7.2 Publikációk listája. 111 7.2.1 E doktori disszertáció eredeti tézisei. 111 7.2.2 Kongresszusok/konferenciák publikációi. 111 8. Függelék. 113 8.1 Rövidítések. 113 8.2 Alapozó szekvenciák. 115 8.3 Vektoros térképek. 117 9. önéletrajz. 120
13 rekesz. Ezért volt okunk feltételezni, hogy a CD22 -/- egerekben csökkenthető az MZ B sejtek száma. Ezért meg kell vizsgálni a CD22 -/- egerek MZ B-sejt-rekeszének méretét és a TI-2 antigénekre adott válasz lehetséges csökkenésének következményeit.: α2,6-szialinsav CD22-ITIM-KO CD22-Tailless Syk SOS? Grb-2 P Y- P Y- P Y- -F ITIM SHC Grb-2 SHIP Lyn PI3K PLCγ2 -F ITIM -F ITIM SH2 SH2 PTPáz SHP-1 3. ábra: Két tervezett egérmodell a CD22 in vivo jelátvitelének tanulmányozására . Bal oldal: CD22-ITIM-KO: Az ITIM-ek tirozinjai fenilalaninokká mutálódtak. Várható, hogy az SHP-1 jelet gátló fehérje-tirozin-foszfatáz már nem léphet kölcsönhatásba a CD22-vel, és így aktiválható. Ezzel szemben a PLCy, Lyn, PI3K és Grb-2 pozitív B-sejt jelmodulátorok megkötése továbbra is lehetséges. Lehetőség van a SHIP megkötésére a SHIP-Grb2-Shc komplexum részeként is. Jobb oldal: CD22-hát nélküli: A 12. exonban lévő stopkodon egy CD22 molekula expressziójához vezet citoplazmatikus domén nélkül. Ez az egérmodell kiegészíti a CD22-ITIM-KO-t. Mindkét modell a jelátvitel és a CD22 adhéziós funkciója közötti kapcsolat tisztázására is szolgál.
14 2.1 Anyagok 2. Anyagok és módszerek 2.1.1 E.coliNM522 baktérium törzsek: (F`lacIq (lacz) m15 proa + prob + (hsdms-mrcb) 5 (lac-proab) supe thi-1 lambda) kezdetben az E klónozó törzs volt. .coliDH5α: F- delta (laczya-argf) u169 phi80delta (lacz) m15 enda1 reca1 hsdr17 deor thi-1 supe44 gyra96 rela1 rpsl lambda - ennek a doktori disszertációnak a későbbi folyamán standard klónozó törzsként alkalmaztuk E. coliBNN12 supe: sevi1. delta (lac-proab) (F trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15) lambdakc-t (kan-cre) alkalmaztunk a loxp szekvenciák funkcionalitásának tesztelésére az alkalmazott célzási konstrukciókban. E. coliJM110: F [trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15] gát dcm supe44 hsdr17 thi leu thr rpsl csipkés galk ara tona tsx delta (lac-proab) lambda szolgáltatott gazdatörzsként azoknak a plazmidoknak, amelyek metiláció-érzékeny restrikciós endonukleázokkal vágtak kellene. 2.1.2 Vegyszerek Hacsak másként nem jelezzük, a laboratóriumi vegyszerek a Roth (Karlsruhe) vagy a Merck (Darmstadt) cégektől származnak. Sóoldat) 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, 0,133 g CaCl 2 2H 2 O, 0,1 g MgCl 2 6H 2O sósavval ph7.2 FACS puffer 1 x PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3
36 loxp loxp pcd22-itim-ko tk neo 1112 13 14 15 célzó genom. Locus loxp loxp tk neo rekombinált Locus Cre deléció loxp rec./ cre-delet. A 11-15. Lokusz exon mutált ITIM-ek (Y F) 1 kb. 6. ábra: A pcd22-itim-ko vektor és az endogén CD22 lokusz homológ rekombinációjának menete. A szelekciós kazetta későbbi törlése Cre rekombinázzal csak a mutált ITIM-eket változtatja meg a 13. és 15. exonban és egy loxp szekvenciát a 14/15 intronban.
43 neo szonda pcd22-3bs-hindiii szonda EBEBE 1112 13 14 15 9,5 kb WT EcoRI fragmens genus Locus EB 11 kb WT BamHI B fragmens célzó EBE tk neo B loxp loxp EB rekombinált lokusz EE 9,5 kb rekombinált 3 kb rekombinált EB 9 kb rekombinált B 6 kb rekombinált B exon 11-15 mutáció (stop kodon) 11. ábra: CD22 vad típusú lókusz és pcd22-ex12-stop rekombinált lokusz a BamHI (B) és az EcoRI (E. restrikciós enzimek hasítási helyeivel). ). A bemutatott fragmensek EcoRI-vel vagy BamHI-vel történő emésztés után keletkeznek. A vad típusú (WT) restrikciós fragmensek változásai akkor fordulnak elő, ha rekombinálódnak az új kazettában található EcoRI interfészek vagy a mutagenezis primerek BamHI interfészén keresztül.
44 a) 11 kb tömeg/tömeg tömeg/farok nélküli M12.2.3 M12.4.1 b) 9,5 kb tömeg/tömeg tömeg/hátsó M12.2.3 M12.4.1 9,5 kb 9 kb 6 kb 3 kb emésztés: BamHI szonda: pcd22-3bs-hiii emésztés: EcoRI szonda: pcd22-3bs-hiii c) tömeg/farok nélküli tömeg/tömeg M12.2.3 M12.4.1 9 kb emésztés: BamHI szonda: neo 12. ábra: A helyesen rekombinált CD22-Tailless ES sejtklónok M12 déli blotjai .2.3 és M12.4.1, mindegyiket egy vad típusú kontroll klón mutatja (tömeg/tömeg). A vad típusú lókusz és a rekombinált lókusz, az EcoRI-vel vagy a bamhival végzett emésztés eredményeként kapott fragmensek és a próbák sematikus ábrázolása, lásd a 11. ábrát. emésztettük a BamHI-vel. A vad típusú lókusz BamHI emésztése 11 kb-os restrikciós fragmenst eredményez. A pcd22-itim-ko konstrukció integrálása a vad típusú lókuszba ezt növeli
45 töredék 14 kb-on. A Prcd22-3bs HindIII és az új kazettán belüli szondát ismét próbaként használtuk. 13. ábra: pcd22-3bs-hindiii-szondás neo-szonda BBB 1112 13 14 15 11 kb WT BamHI B fragmens gen. Rekombinált lokusz célzása a B neo loxp BB 14 kb-os rekombináció. A BamHI B fragmens 11-15. Exonja mutált ITIM-ek (Y F) 1 kb. 13. ábra: CD22 vad típusú lókusz és pcd22-itim-ko-val rekombinált lokusz a BamHI (B) restrikciós enzim hasítási helyeivel. A bemutatott töredékek a BamHI-gyel történő emésztés után keletkeznek. A neo/tk kazetta integrálásával a rekombinált lókusz 3 kb-mal megnövekszik a vad típusú lókuszhoz képest. Például a 14. ábra az YFtar3F1 és YFtar10E3 CD22-ITIM-KO klónok Southern blot-ját mutatja. A blotok azt mutatták, hogy az YFtar3F1 és YFtar4E6 mentesek további integrációktól. Az YFtar10E3 esetében azonban a konstrukció egy másik példányát találták a genomban (nem látható).
57 pcd22-itim-ko loxp loxp 1 kb tk neo 1112 13 14 15 1) A genomi szekvencia megtalálása 2) Klónozási stratégia kidolgozása 3) PCR klónozás 4) Szekvencia 5) HSV-tk loxp loxp neo törlése 8 9 10 1112 13 14 15 129/ola pcd22-itim-ko-ext-tk exon 8-15 mutáns ITIM (YF) 17. ábra: A pcd22-ITIM-KO C57BL/6 vektor homológ rekombinációjának gyakoriságának növelése nem izogénben A 129-ES sejtvonalakat a vektort PCR-rel amplifikált E14Tg2a DNS-darabbal meghosszabbítottuk. Az előfeltétel az CD22 egér szinte teljes sorozatának megtalálása volt az adatbázis keresés során. Célzási kísérletet hajtottunk végre a WW6 ES sejtvonalon, a képen látható két pcd22-itim-ko-ext (nem látható) vektor köztes szakaszával (lásd a szöveget).
58 Konstruálás Tailless (03/99) ITIM-KO (11/99) Tailless (05/00) ITIM-KO (05/00) ITIM KO (06/00) ES sejtvonal A vizsgált klónok száma PCR pozitív PCR reprodukció. C57BL/6-III 300 8-4 C57BL/6-III 500 5 3 3 C57BL/6-III 200 3 2 2 C57BL/6-III 150 2 2 2 Southern Blot C57BL/6-III 400 0 - - - megváltozott tenyésztési körülmények: Új közeg, PBS, Pen/Strep, Gln, β-me ITIM-KO (08/00) tárcsázás a PCR-Optim szerint. Tilless (08/00) tárcsázás a PCR-Optim szerint. ITIM-KO (11/00) Hátsó (11/00) ITIM-KO (02/01) Hátsó (07/01) BALB/cI 600 0 - - - 150 1 0 - - BALB/cI 600 1 0 - - 600 7 0 - - C57BL/6-III 500 6 2 - C57BL/6-III 400 12 11 - E14Tg2a 500 2 0 - - E14Tg2a 650 2 0 - - Des. M12 2.1, 2.3, 4.1, 4.2 YFtar3F1, 4E6, 10E3 M12 8D1, 10D5 YFtar12B5, 12A4 YFtar29D2, 30F1 M12 15F5, 17B3,17B7, 17C7,18A3, 18B5,19A1, 19F2,21C4, 21E5d221 konstrukt -itim-ko pcd22-itim-ko-ext-tk, használja az ESGRO ITIM-KO (10/01) WW6 400 0 - - - ITIM-KO E14Tg2a 960 0 - - - 1. táblázat: Az összes géncélzási kísérlet áttekintése ennek a doktori disszertációnak és a kapott homológ módon rekombinált klónoknak
59 hónap/év klón átjáró injektor fiatal párzás 05/00 M12 2,3 M12 4,1 kb P 30 kb P 30 06/00 YFtar3F1 kb P 21 09/00 M12 10D5 kb P 17 09/00 YFtar12B5 kb P 17 YFtar3F1Cre C/B2 kb. P 32 B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann nincs - nincs - nincs - 2 kiméra B. Kneitz nincs - BL/6-mal, csíravonal-átvitel nincs 12/00 12/00 01/01 03/01 03/01 04/01 05/01 07/01 08/01 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2, C/B4 YFtar3F1Cre B1 YFtar12B5 Cre S2F4, S2B5 Y S1C8 YFtar12B5 Cre S1F7, S2F7 YFtar12B5 Cre S1A1, S3A7, S3D8 YFtar12B5 CreS3B8 kb. P 32 B. Kneitz 8 fiú, közülük 4 kiméra kb. P 32 B. nincs - kb. P 32 Ledermann nincs - kb. P 34 B. Kneitz 2 halott, 6 halott - kb. P 32 kb. P 26 kb. P 26 B. Kneitz B. Kneitz B. Ledermann 5 fiú, közülük 1 kiméra 7, 1 magas kiméra (elhunyt) nincs - kb. P 27 B Kneitz nincs - kb. P 27 B Kneitz nincs - kb. P 28 B. Kneitz nincs - BL/6-mal, nincs csíravonal-átvitel BL/6-mal, nincs csíravonal-átvitel n - 2. táblázat: A doktori disszertáció során elvégzett homológ rekombinált és teljesen jellemzett ES sejt klónok összes blasztociszta injekciójának áttekintése
63 vektor pcd22-itim-ko a megszakított SHP-1 kötés tekintetében nagyon valószínű. 149 39 35 CD22-ITIM-KO 4A1 147 53 48 CD22-ITIM-KO 6D4 140 48 35 CD22-wt Ib.D4 148 37 41 CD22-wt Vb.C3 4 6 Kontroll IgM CD22 a2,6-sia 18. ábra: A CD22 és az a2,6-sziálsav felszíni expressziója a CD55 tirozin-foszforilációjának és SHP-1-asszociációjának vizsgálatára kiválasztott J558L-CD22-wt és J558L-CD22-ITIM-KO klónokon. A felületi markerek expresszióját hisztogramként mutatjuk be, az MFI-t minden hisztogramra megadjuk.
68 WT CD22 -/- 55,5 89,5 10,5 6,5 95,5 58,7 4,5 2,8 43 67 20,9 33 59,5 92,1 7,9 5,1 B220 + Sialidase NeuGc-SA 63,5