Klónozás
Mit szólnál egy klónodhoz? Valaki, aki reggel felkel és elmegy érted iskolába, elvégzi a házi feladatát és rendet rak a szobában, hogy legyen elég ideje a mozira? Remek ötlet, vagy talán nem?
4. A génklónozás eszközei
A kutatók különféle molekuláris eszközöket használnak a klónozáshoz. A restrikciós enzimek (pontosabban a restrikciós endonukleázok) nélkülözhetetlenek, amelyek képesek felismerni és hasítani a DNS-t bizonyos pozíciókban. A restrikciós enzimek megtalálhatók a baktériumokban, és összehasonlíthatók az őrző kutyákkal: Megóvják a baktériumokat a vírusok behatolásától. A restrikciós enzimek felismerik a vírus DNS-ét, és az restrikciónak nevezett folyamatban szétbontják. A restrikciós enzimek megkülönböztethetik a saját és az idegen DNS-t, mert a saját DNS-ét kémiailag egy metilcsoport jelöli, amely úgy működik, mint egy zászló. Az idegen DNS azonban nem viseli ezt a zászlót.
A restrikciós enzimek rendkívül specifikusan működnek: felismerik a rövid DNS-szekvenciákat, és ezen a ponton elvágják a DNS-szálat. A kutatók által a kísérletek során gyakran alkalmazott restrikciós enzimet Eco RI-nek nevezik, amely az első restrikciós enzim, amelyet az Escherichia coli (E. coli) baktériumban fedeztek fel. Felismeri és kivágja a GAATTC szekvenciát, úgynevezett ragadós végeket hagyva maga után (lásd a „Rekombináns DNS technológia” filmszekvenciát). Az így létrehozott DNS-darabok (fragmensek) viszonylag könnyen összekapcsolhatók egymással (lásd 2.1. Ábra).
A restrikciós enzimeken kívül a plazmidok a klónozás másik eszközei. A plazmidok „gén taxik”: Fel tudják venni az idegen DNS-t, és átvihetik a baktériumokra. A baktériumok, például az E. coli, átveszik a gének és fehérjék termelését. Az E. coli baktériumok számos laboratóriumban a fő tesztorganizmusok, és ezek a legjobban kutatott élőlények.
A klónozás működéséhez a kutatók egy trükköt alkalmaznak: az alkalmazott plazmidokban van egy olyan gén is, amely megadja a baktériumoknak az ampicillin antibiotikummal szembeni rezisztenciát. Ez az ellenállás később fontosnak bizonyul.
Kísérletünk során az Eco RI restrikciós enzim levágja az emberi DNS-t, amelyet a nyálmintából nyertünk. Ez több ezer darab DNS-t hoz létre - amelyek egyike tartalmazza a keresett inzulin gént. Ugyanazokat az enzimeket használjuk a baktériumok plazmidjainak levágására. A ragacsos végek miatt az egyes darabokat visszahelyezhetjük. Sok plazmid nem vesz fel semmit, sokan felveszik az emberi DNS-t, és néhányan felveszik a keresett inzulingént. Ezután az összes plazmidot bejuttatjuk az E. coli baktériumokba.
Most az összes baktériumot elosztjuk egy tápközeggel ellátott tányéron, amelyen a baktériumok elvileg nem tudnak növekedni, mert a lemez ampicillin antibiotikumot tartalmaz. Ezzel a lépéssel a búzát elválasztják a pelyvától: Minden baktérium, amely bevett egy plazmidot, növekedhet a lemezen és kolóniát képezhet, mert a plazmid rezisztenssé teszi őket ampicillinnel szemben. A baktériumok szaporodnak, és velük együtt a kívánt inzulin gén.
Ezen a ponton több ezer emberi DNS-darabot klónoztunk, és nem csak azokat, amelyek érdekelnek minket. A következő lépés, az összes kolónia átvilágítása nagyon összetett.
Hogyan találhatjuk meg azt, aki az inzulin génünket hordozza a több ezer klónból? Ha már ismerjük az inzulingén DNS-szekvenciájának egy részét, akkor előállíthatunk egy körülbelül 30 bázispár hosszúságú mRNS-darabot, amely mint szonda dokkol az inzulingén-szekvenciára. Ez a szonda radioaktív vagy fluoreszcenciával van ellátva, hogy meghatározzuk, mely klónokkal dokkol. Ennek a szondának köszönhetően megtaláljuk azt a klónt, amely inzulin génünket tartalmazza (lásd a 2.2. Ábrát). Ezzel a technikával sok más gént lehet klónozni, például növekedési hormonokhoz és interferonhoz, olyan géntermékekhez, amelyeket gyógyszerként is használnak.
A génklónozás most sikeresen befejeződött, és világossá válik, miért használják erre a baktériumokat, és nem a magasabb rendű organizmusokra: a magasabb rendű szervezetek nemi úton szaporodnak. Ezeknek az élőlényeknek a szexualitásnak megvan az az előnye, hogy a genetikai felépítés újrakombinálódik, és hogy új, új tulajdonságokkal rendelkező egyének alakulnak ki belőle. Ez előnyöket teremt az evolúcióban. A kutatók számára azonban ez az új genetikai kombináció zavaró, mert megváltoztathatja az inzulin gént is.
A kutatóknak genetikailag azonos állatokkal kell dolgozniuk: egy kísérlet során mindig csak a klónok reagálnak ugyanúgy. Amikor a kutatók egy kábítószert akarnak tesztelni, mindig ugyanazon törzsből származó egereket használnak. Az ilyen egér törzseket beltenyésztés segítségével tenyésztik, vagy szorosan rokon állatokat kereszteznek egymással.