Laboratóriumi folyóirat - Módszerek - Optimalizált sejttenyésztési táptalaj
Mirja Krause
Az oldható rekombináns fehérjék termelése a baktériumsejtekben nem mindig működik zökkenőmentesen. Mirja Krause elmagyarázza, hogy az újonnan kifejlesztett En Base sejttenyésztési rendszer hogyan képes jelentősen növelni a sejtsűrűséget és az egy sejtben az oldható fehérje mennyiségét.
Alapvetően a rekombináns fehérjék expressziójára használt sejttenyészetek feladata nagyon egyszerű: a lehető legaktívabb oldható fehérjéket kell előállítaniuk. Sok standard sejttenyésztési protokoll mellett azonban ez csak részben vagy néha egyáltalán nem működik. Az E. coli sejtek rázólombikban történő tenyésztésének legismertebb protokollja valószínűleg a Sambrook protokoll, amelyet Tom Maniatis "Molecular Biology Bible" felsorol. Több mint 20 éve a molekuláris biológusok ezt a protokollt használták útmutatóként, ami gyakran működik - de nem mindig.
Azokat a fehérjéket, amelyek csak gyengén vagy egyáltalán nem expresszálhatók a Sambrook vagy más szabványos protokoll használatával, általában „nehéz jelölteknek” tekintik, amelyek speciális trükköket igényelnek. Ezeket az eseteket a munkacsoportunkban is megtalálták, és gyakran kerestük az expresszált fehérje sávjait SDS-PAGE gélekben nagyítóval.
Túlevett baktériumok
A fehérje baktériumkultúrában történő expressziójának gyenge hozama oka gyakran az embereknél is előforduló jelenség: a baktériumok egyszerűen túlevnek. A rázkultúrák táptalajai általában szakaszos tenyészetekként „futnak”, és az összes komponenst és tápanyagot tartalmazzák a további tenyésztéshez az első másodperctől kezdve. A folyamat többnyire nem kontrollált, ami azt jelenti, hogy az olyan fontos paramétereket, mint a pH-érték, az oldott oxigén mennyisége és a táptalaj glükózkoncentrációja nem szabályozzák.
Ennek eredményeként a gyorsan növekvő baktériumok magas légzési aránya meghaladja az oxigén transzfer sebességét a tenyészetbe. Ez gyorsan oxigénhiányt és ezáltal a növekedés korlátozását eredményezi. A baktériumok most lassan növekednek és csökkentik a fehérjetermelést. Anyagcseréjüket az anaerob tenyésztési körülményekhez igazítják, és metabolitokat szabadítanak fel, amelyek csökkentik a pH-értéket. Ezenkívül a standard komplex közegben jelenlévő kontrollálatlan glükózmennyiség túlzott anyagcseréhez vezet. Ennek eredményeként további acetát halmozódik fel, ami tovább csökkenti a táptalaj pH-értékét, amíg a túlevett baktériumok végül "megbetegednek".
Az egész megerősödik, ha a rázólombikokat - mint sok laboratóriumban szokás - pamutdugóval, alumíniumfóliával vagy fém kupakkal zárják le. Az oxigéntranszfer a tenyészetekbe nullára csökken, és az anaerob, azaz kedvezőtlen tenyésztési körülményekre való átmenet felgyorsul. Az oxigén lombikba juttatására megoldást kínálnak az öntapadó, steril, eldobható lezáró membránok, az úgynevezett AirOtop tömítések. Az AirOtop membránok kívülről semmilyen baktériumot nem engednek be a tenyészetbe, hanem oxigént. A túlevés fent leírt problémája továbbra is fennáll.
A sejtek egészségének megőrzése érdekében egy meghatározott mennyiségű glükózt szivattyúznak folyamatosan a fermentációs reaktorokba az úgynevezett fed-batch folyamatban. Ugyanakkor az érzékelők szabályozzák a pH-értéket és az oxigéntartalmat. Ily módon nagyon nagy sejtsűrűség érhető el, és növelhető az oldható rekombináns fehérjék termelése.
De hogyan lehet az adagolási szakaszos elvet átvinni a bioreaktorokról a lombikok vagy mikrotiterlemezek rázására? Egyszerűen: azzal, hogy a baktériumokat "cukor diétára" helyezzük.
Közepes Finnországból
Néhány évvel ezelőtt a finn Oulu Egyetem Peter Neubauer csoportja kifejlesztette az EnBase (enzim-alapú-szubsztrát-szállító) sejttenyésztési rendszert, amely a keményítő enzimatikus emésztésével szabályozott módon szabadítja fel a glükózt a táptalajba (Panula-Perälä et al., Microbial Cell Gyárak, 2008, 7:31). Időközben a bioprocesszor-mérnök, Neubauer távoli északról a TU Berlinbe költözött, és csapatával létrehozott egy másik közeget, az EnBase Flo nevet, amely oldható formában tartalmaz glükóz-felszabadító polimereket.
Cukor diéta
Az EnBase Flo segítségével a tápközegben lévő glükóz mennyisége szabályozható a tenyészetben beállított enzimkoncentráció (glükoamiláz) segítségével (Krause és mtsai., Microbial Cell Factories 2010, 9:11). A cukortartalmú étrend megakadályozza a baktériumok káros anyagcseréjét, és biztosítja, hogy a pH-érték két napnál tovább stabil maradjon, és így lényegesen hosszabb legyen, mint az LB táptalaj esetében, amelyben a pH-érték csak hat-nyolc órán át állandó. Az úgynevezett emlékeztető tabletták emellett erősítik a pH-stabilizáló hatást. A baktériumok egészségesek maradnak, és kontrollált és stabil körülmények között tenyészthetők, amelyekben lényegesen nagyobb sejtsűrűség érhető el. Ezenkívül az oldható, aktív fehérje hozama akár tízszeresére nő. Időközben az EnBase Flo Medium, amely nemcsak a laboratóriumi méretekhez, hanem a nagy áteresztőképességű folyamatokhoz is alkalmas, tabletta formátumban is elérhető EnPresso néven, ami még könnyebbé teszi a termesztést.
A következő rövid protokoll bemutatja, hogy mennyire egyszerű a sejttenyészet az EnBaseFlo rendszerrel. Szüksége van egy 500 ml-es steril lombikra, steril vízre, antibiotikumokra, induktorra és egy enpresso tabletta készletre. Az első lépés egy előkultúra előkészítése. Ezt beolthatjuk folyékony éjszakai tenyészetből, glicerin pálcából vagy agarlemezről. Ezután steril körülmények között adjunk hozzá 50 ml steril vizet és két közepes tablettát az 500 ml-es lombikba, várjuk meg, amíg a tabletták feloldódnak, majd adjuk hozzá a szükséges antibiotikumot és 50 µL EnZ’Im-t (glükoamiláz). Ezután az előtenyészetet beoltjuk (OD 600 = 0,05-0,15), a lombikot lezárjuk az AirOtop membránnal, és megkezdjük a tenyésztést. Egy éjszakán át tartó tenyésztés (16-20 óra) után emlékeztető tablettát, 50 µL EnZ’Im-et és induktort adunk hozzá. A tenyésztést ezután folytatjuk, és a sejteket 24 óra múlva gyűjtjük.
Utolsó változtatások: 2011.02.23