Tanulmányok a polifenolos almalé összetevőinek antioxidáns hatékonyságáról
Tanulmányok az emberi vastagbélsejtek polifenolos almalé összetevőinek antioxidáns hatékonyságáról Értekezés a Kaiserslauterni Műszaki Egyetem Kémiai Tanszéke által a természettudományok doktora (D386) tudományos fokozat odaítéléséért, Sandra Schäfer Kaiserslautern diplomás élelmiszer-vegyész előadásában, 2006
Ez a munka 2002. június és 2005. november között jött létre a Kaiserslauterni Műszaki Egyetem kémiai, élelmiszer-kémiai és környezeti toxikológiai tanszékén. A tudományos megbeszélés napja: 2006. április 25. Vizsgabizottság elnöke: Prof. Dr. H. Sitzmann 1. riporter: Prof. Dr. G. Eisenbrand 2. előadó: Prof. Dr. Dr. D. Schrenk köszönöm Prof. Dr. G. Eisenbrand és Dr. C. Janzowski a téma biztosításáért, javaslatokért és jóindulatú támogatásért a doktori időszakban.
Tartalom 5.5.2.1 Aszkorbinsav hozzáadása. 152 5.5.7.1 pH-függőség és reverzibilitás. 154 5.5.8 A FORMÁK STABILITÁSÁNAK ÖSSZEFOGLALÁSA 157 6 MEGBESZÉLÉS ÉS KILÁTÁS. 158 7 ÖSSZEFOGLALÓ. 168 8 IRODALOMJEGYZÉK. 170 9 FÜGGELÉK. I 9.1. A MEGJELENÉSEK NEM TARTALMAZNAK. I 9.2 önéletrajz. V 9.3 PSTER BEJELENTÉSEK ÉS PUBLIKÁCIÓK. VI
A rövidítések listája ph pk a PKA PKC PKZ Plt Plz Que, QQ - Qq ra (p) e RS RP RT Rut SD SE SGLT1 SD SRB SSA SSB SULT TAC TBARS TEAC TCA TEA tgsh TI% TNB TRAP Tris UDPGT UDP VdF hidrogénion-koncentráció logaritmusa logaritmus Savdisszociációs állandó protein-kináz A-protein-kináz C primer (humán) vastagbélsejtek phloretin phloridzin quercetin quercetin-o-semiquinone quercetinquinone rekonstituált almalé (törköly) extrakte reaktív oxigénfajok keverékei, engl. reaktív oxigénfajok esetén a fordított fázis retenciós idő rutin szórás a szórás standard hibájához standard hibához nátriumfüggő glükóz transzporter szuperoxid-diszmutáz-szulfozozamin B-szulfosalicilsav egyszálú törés, engl. egyszálú töréshez fenol-szulfát-transzferáz összes antioxidáns kapacitása tiobarbitursav-reakcióképes anyagok Trolox ekvivalens antioxidáns kapacitás triklór-ecetsav-trietanol-amin teljes glutation Farokintenzitás, angol. farokintenzitás esetén az 5-tio-2-nitro-benzoát teljes peroxilgyök-csapdázási potenciálja tris (hidroxi-metil) -amino-etán UDP-glükuronil-transzferáz uracil-difoszfát A német gyümölcslé-ipar szövetsége e.v.
Az elméleti alapokat megfelelő étrend és életmód akadályozhatja meg [Donaldson, 2004]. A vastagbél karcinogenezisének molekuláris mechanizmusai A karcinogenezis egy többlépcsős folyamat, amely molekuláris és sejtes változásokat is magában foglal. A folyamat három összekapcsolt szakaszra bontható: Tumor iniciáció, promóció, progresszió (3.3. Ábra). I N I T I A T I N P R M T I N a növekedést szabályozó gének normál sejtmutációja: APC, K-ras és mások megindították a sejtek szelekciójának növekedését az iniciált sejtek aberrált kripta góc mutáció, deléció DCC, p53 endogén FAP, HNPCC genotoxot okoz. Subst. Vírusok RS gyulladás-mediátorok Szövetkárosodás, CU, MC Adenoma P R G R E S S I N Selection Carcinoma Invasion Metastases 3.3. Ábra: A vastagbélrák kialakulásának többlépcsős folyamata, módosítva [Schulte-Hermann et al., 2004]; Rövidítések: APC: adenomatous polyposis coli; FAP: családi adenomatózus polipózis szindróma; HNPCC: nem polipos kolorektális rák szindróma; CU: fekélyes vastagbélgyulladás; MC: Crohn-betegség; DCC: vastagbélrákban törölve 9
Elméleti alapelvek Magas fehérjefogyasztás esetén fokozódik a fehérjék, peptidek és karbamid átjutása a vastagbélbe. A baktériumok anyagcseréje többek között előállítja az ammónium-kationt (NH + 4). Ez állatkísérletekben citotoxikus, és szerepet játszhat a karcinogenezisben. [Biesalski, 1999] 12
Elméleti alapok NADP + NADPH FAD vörös FAD ox lipid peroxidációs kinon szemikvinon gyök redox ciklus enzim inaktiváció H Haber-Weiss reakció 2 DNS károsodás Fe Fenton reakció Fe 2 - H 2 2 SD 2 2 CAT GSH NADP + GPx GSR H 2 GSSG NADPH 3.4. Ábra: Példák különféle RS, védekezési mechanizmusok és károsodások kialakulására (zöld: méregtelenítés, piros: RS reakciók közvetlen következményei; módosítva [Kelly et al., 1998, Sies, 1985]; CAT: kataláz, GSH: redukált glutation, GSSG: oxidált glutation, GPx: glutation-peroxidáz, GSR: glutation-reduktáz, SD: szuperoxid-diszmutáz, CYP: citokróm P450-függő monooxigenázok A H hidroxilgyök a leginkább reaktív oxigénfajoként működik [Sies, 1991], standard 2,31 V redukciós potenciállal, erősen oxidálva [ Halliwell és Gutteridge, 1999]. H számos biológiailag releváns rendszerben fordulhat elő, például a nehézfémion-katalizált Haber-Weiss reakció révén (pl. Rézzel vagy vassal, - 3.7. Egyenérték) 2 és H2 2. A vasion által katalizált részleges reakció Fenton reakcióként is ismert (Eq. 3.6) [Eisenbrand és Metzler, 2005]. 2 - + Fe 3+ 2 + Fe 2+ (3,5) Fe 2+ + H 2 2 H + H - + Fe 3+ (3,6) 2 - + H2 2 H + H - + 2 (3,7) 14
Elméleti alapok 3.3. Oxidatív stressz és következményei 3.3.1 Lipidperoxidáció (Lipid peroxidation, LP) A lipidek fontos szerepe a sejtkomponensekben aláhúzza az oxidáció által a biológiai rendszerekben bekövetkező lehetséges károsodásuk fontosságát. Ez az oxidációs reakció, amelyet LP láncreakciónak is neveznek, három fázisra oszlik: iniciáció, terjedés, termináció és vázlatosan a 3.5. LH R RH Initiation LH L 2 LH Lánc meghosszabbítás L X Terminálás stabil termék 3.5. Ábra: Az LP áttekintése, [Kelly et al., 1998] szerint; LH: zsírsav; R: reaktív fajok; X: molekula, amellyel L reagál. A láncreakciót olyan reaktív fajok indítják el, amelyek képesek elválasztani egy hidrogénatomot egy metiléncsoportból (iniciáció). A H az összes zsírsavval indítja a láncreakciókat, míg a 2 csak néhány, különösen az aktivált zsírsavval reagál [Halliwell és Gutteridge, 1999]. Ez alkil- és peroxicsoportokat hoz létre, amelyek ezután más zsírsavakkal reagálnak. A gyökös láncreakció a peroxidok lebontása útján ágazik ki, amelyekből két gyök keletkezik (terjedés). Láncszakadás akkor következik be, amikor a gyökök reagálnak olyan molekulákkal, amelyek stabil termékeket képeznek (termináció). [Belitz és mtsai, 2001, Kelly és mtsai, 1998] 17
Elméleti alapok Az LP ideális szubsztrátjai a többszörösen telítetlen zsírsavak biszallil-metiléncsoportokkal. Ezekben a pozíciókban a szén-hidrogén kötések alacsony disszociációs energiákkal rendelkeznek, így a hidrogén gyökös reakcióval történő absztrakciója könnyen lehetséges. [Kelly és mtsai., 1998] A lipidperoxidáció és az ezzel kapcsolatos fragmentáció sokféle telített és telítetlen molekulát eredményez, pl. Alkánok, aldehidek, ketonok és furánok [Belitz et al., 2001]. Az aromakomponensek tulajdonságain kívül ezek a reaktív molekulák citotoxikus, genotoxikus és mutagén hatásokkal is bírhatnak [Marnett, 1999]. A malondialdehid (MDA) képződését egy LP termék példaként kell megmagyarázni: R 2, 2 RH CCH 3 lánc meghosszabbítás CCH 3 ciklizáció CCH 3 2, RH R CCH 3 H hő, H + CCH 3 fragmentáció malondialdehid + H CCH 3 3.6. Ábra: Malondialdehid (MDA) képződése α-linolénsavból [Belitz és mtsai., 2001] szerint Az MDA többszörösen telítetlen zsírsavakból képződik peroxilcsoporttal történő reakcióval, oxigénnel, ezt követő ciklizációval és fragmentálódással (18. ábra)
Elméleti alapelvek NH 2 NH 2 HN NHNNNNNH 2 NNHHNNHNNH 8-hidroxiguanin 2-hidroxi-adenin-8-xiadenin HN NH CH 3 HHH HN NHHHNH 2 HN HNN NH 2 CH timin-glikol 5- (hidroxi-metil) uracil-2,6-diamino 5-formamidopiridin 3.7. Ábra: Példák oxidált pirimidinekre és purinokra [Meneghini, 1997] szerint. A D támadása sokféle terméket eredményezhet, pl. A guanin oxidációja a puringyűrű 4, 5 vagy 8 helyzetében (8-xo-dezoxiguanin vagy 8-hidroxidezoxi-guanin, 8-H-dG), amely gyűrűvel nyitott termékekhez, például 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidinhez ( FaPy) tovább reagál (3.8. Ábra). A pirimidinek elleni támadás bázikus dimerekhez is vezethet. [Halliwell és Gutteridge, 1999, Jaruga és Dizdaroglu, 1996, Kelly és mtsai, 1998] HN NH 2 NNNR dezoxiguanin xidáció H redukció NH 2 HN NNNR gyűrű nyitás NH 2 HN NNNRHH 8 HG NH 2 HN NCNNRHH + e -, + H + + e -, + H + + e -, + H + NH 2 HN NN NH R gyűrűnyílás NH 2 HN NNNRHHNH 2 HN NNNRH FaPy 8-H-dG 3.8. ábra: D-oxiguanin módosítása H-gyökökkel [Halliwell és Gutteridge szerint, 1999] 20
Elméleti alapok A DNS-javító DNS-javító rendszerek felismerik a módosított és nem egyező DNS-bázisokat. Ilyen módosítások elsősorban oxidált bázisok [Christmann és mtsai, 2003]. Amikor a károsodott bázist felismeri és kivágja a DNS-glikoziláz, úgynevezett apurin/apirimidin (AP) helyek jönnek létre, és az oxidatív DNS károsodás legfontosabb helyreállító rendszere, a bázis kivágás javításának (BER) javító kaszkádja elindul ( 3.11. Ábra). DNS-glikoziláz AP-liáz DNS-glikoziláz AP-liáz APE1 APE1 Pol δ/e Polβ Polβ Fen-1/PCNA Polβ Lig1 Lig3 3.11. Ábra: a BER sematikus ábrázolása [Scharer, 2003] szerint; zöld: rövid folt - ösvény, lila hosszú folt ösvény; Rövidítések a szövegben. Az AP endonukleáz-1 (APE1) hidrolizálja a foszfátkötést az abaszikus helyek 5 oldalán. A β polimeráz (Polβ) egy nukleotidot szekvenciában illeszt be az abaszikus helyre, majd AP-liáz aktivitása miatt eltávolítja az abaszikus helyet. A DNS ligáz III (Lig3) bezárja a nicket, és így helyreállítja az eredeti DNS szekvenciát. Ha a BER-t bifunkcionális DNS-glikozilázok/APLyázok okozzák 25
Elméleti álláspont [Manach et al., 2004]. Ezenkívül lehetségesek az elágazások, valamint a nem flavonoidokkal való kötések is. A proantocianidinek hozzájárulnak a növényi ételek keserű és összehúzó ízéhez [Jorgensen et al., 2004]. Az almabor almában a polimerizáció mértéke döntően négy és tizenegy flavanol egység között van [Manach et al., 2004]. 3.4.1.2 Floretin-származékok A floretin és annak glikozidjai (főleg a floretin-2-glükozid = kloridzin és a floretin-2-xiloglükozid) a dihidrokalkonokhoz tartoznak, felépítésüket a 3.13. Ábra mutatja. H H H R R = H: floretin R = glükóz: floridzin 3.13. Ábra: A floretin és a floridzin szerkezete Természetes módon szinte kizárólag az almában, valamint az almafa leveleiben és kérgében fordulnak elő. A phloretin másik kiindulási pontja az apigenin mikrobiális lebontása a vastagbélben (3.4.4. Fejezet). 3.4.1.3 Hidroxi-fahéjsav-származékok Az egyik leggyakoribb hidroxi-fahéjsav a koffeinsav, amely a természetben általában kininsavval vagy glükózzal észterezve található meg. Az 5-koffeil-kininsav klorogénsav néven is ismert (3.14. Ábra). 30-án
Elméleti alapok HHRR = H: koffeinsav R = kininsav (C5): klorogénsav HH 4 5 2 3 1 6 HH kininsav CH 3.14. Ábra: A koffeinsav és a klorogénsav szerkezete [Belitz et al., 2001] szerint A klorogénsav főleg a kávéban és az almában található meg, de más alma- és csonthéjas gyümölcsökben is [Belitz et al., 2001, Iwai et al., 2004]. Erős kávéban akár 500-800 mg/l szint is elérhető [lthof et al., 2003]. A nem kávét fogyasztók napi 100 mg klorogénsavat, a kávéfogyasztók viszont 500-1 000 mg/napot fogyasztanak [lthof et al., 2001]. 3.4.2 Felszívódás Mivel a fenolos vegyületek in vivo bioaktív hatásokat tulajdonítanak, a vékonybélben történő felszívódás előfeltétele. A 3.15. Ábra szemlélteti az étkezésből származó polifenolok lehetséges útjait a gyomor-bél traktusban. Polifenolok Polfenolok Szövet Vékonybél Máj Vastagbél Epe Vese ürülék Vizelet 3.15. Ábra: A polifenolok lehetséges útjai emberben, [Scalbert és Williamson, 2000] szerint A felszívódás mértéke és mechanizmusa ellentmondásos (3.3. Táblázat). 31
Elméleti alapok 3.3. Táblázat: In vivo és in vitro vizsgálatok kiválasztása a kvercetin-származékok felvételéről Tanulmány Anyagfelvétel Metabolitok Irodalom ileosztómiás betegek Quercetin 1 glikozidok Hagyma Rutin 24% 52% 17% [Hollman et al., 1995] Vizsgálati alanyok (plazma 24 órán keresztül) Glikozidok hagyma rutinglikozidok alma