Metabolikus állapot jellemzése nem emberi főemlősökben intravénás glükóz toleranciával
Összegzés
Ennek a protokollnak a célja az intravénás glükóztolerancia tesztek (IVGTT) standard módszerének bemutatása a glikémiás kontroll elvégzésére nem főemlősökben, hogy értékeljék és értékeljék metabolikus állapotukat az egészségestől a diszmetabolikusig.
Absztrakt
Bevezetés
Az IVGTT egy kényelmes funkcionális vizsgálat, amelyet rutinszerűen alkalmaznak a β-sejtek működésének meghatározására emberekben különböző metabolikus körülmények között 5, 7. A T2D állatmodelljeiben jól elismert eszköz az olyan állatok jellemzésére, amelyek a metabolikus betegség progressziójától kezdve egészséges és diszmetabolikus hiperglikémiás állapot között mutatnak 8, 9. A T2D legközelebbi állatmodelljét nem emberi főemlősök (NHP) mutatják be, amelyek közül az egyik A Cynomolgus makákók figyelemre méltó példák. Ezekben az állatokban természetesen a T2D fejlődik ki, az életkor és az elhízás ugyanazokkal a kockázati tényezőivel járul hozzá az előfordulásához, mint az embereknél 10. Ezenkívül hasonló a betegség progressziója és a hasnyálmirigy patológiája amiloid lerakódásokat mutat, mint a diszmetabolikus betegség 11.
Itt beszámolunk az IVGTT NHP-kben történő előállításának szokásos eljárásáról az állatok metabolikus állapotának kolóniás jellemzésének részeként. Ez a módszer egyszerű, összehasonlítva más, időigényesebb és költségesebb technikákkal. 2. Az IVGTT hasznos az állatok nagy kolóniájának gyors és gyakori jellemzésére. Ha figyelembe vesszük a glikált hemoglobin (HbA1C) szintjét, az állat étrendjét és táplálékfelvételét, valamint az izomtömeg és a testzsír százalékát, akkor az IVGTT általában elegendő az állat anyagcsere-állapotának és a nyílt cukorbetegség felé haladásának jellemzésére 8.
A HbA1C az átlagos glikémiás szintet képviseli a vörösvértestek élete során, megbízhatóan mérve a glükózszintet az elmúlt hat hét-három hónap során. Ha az IVGTT éheztetett bázis vérmintájából mérjük, ez az érték ablakot enged a glikémiás kontrollra az eljárások közötti hónapokban. Ha az állat a legutóbbi IVGTT óta átállt a diszmetabolikus állapotból, a korábbi diabéteszes értéknél jóval magasabb HbA1c-érték azt jelentené, hogy az átmenet hamarosan az utolsó IVGTT-jük után kezdődött, míg az előző értékükhöz közelebb eső HbA1c-érték azt jelezte, hogy nemrég váltottak. Általában rhesus makákókban a 6% -nál nagyobb HbA1C-szint kóros, és rossz vércukorszint-szabályozásra utal 10, 23.
A glikémiás szintet az állat viselkedése és egészségi állapota szempontjából kell értelmezni. A diabéteszes makákók - az emberekhez hasonlóan - hiperfágiát, polidipsziát és polyuriát mutatnak. Az állatok csoportos elhelyezése jelentős kihívásokat jelent ezen mutatók mérése, valamint a diszmetabolikus és diabéteszes majmok számára szükséges egyedi ellátás szempontjából. Javasoljuk az állatok külön-külön történő elhelyezését, hogy minél több személyes gondoskodás történhessen, és a majom egészségére vonatkozó viselkedési markerek könnyebben ellenőrizhetők legyenek. Ezenkívül a diabéteszes makákók súlycsökkenést, megnövekedett lipidprofilt (megnövekedett koleszterinszint, hipertrigliceridémia) és az ásványi anyagcsere károsodását mutatják a szérumkémiában. Fontos mérni a máj és a vese működésének markereit a szérum kémia területén, mivel ezeknek a szerveknek a károsodása gyakran előrehalad az anyagcsere-zavarok/cukorbetegségek szövődményei miatt, és együttesen meghatározói lehetnek a glikémiás, lipid- és ásványianyag-egyensúlyhiánynak 9, 11, 18, 24, .
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Az észak-karolinai kutatási campuson (NCRC) található David H. Murdock Kutatóintézet, az IACUC valamennyi állatkísérletét jóváhagyta a Diabétesz és prediabétesz nem humán prímamodelljének/inzulinrezisztencia és a terápiák hatékonysága az inzulinérzékenység javításában című 14-017. és az anyagcsere funkciója.
1. Az állatok kiválasztása és a vizsgálat előkészítése
2. Állatok szedálása és előkészítése
MEGJEGYZÉS: Az IVGTT eljárás 8 vérmintavételi pontból áll egy időben (Asztal 1).
100 mg/dl-rel magasabb, mint az éhomi kiindulási plazma glükózszint.
4. Állatok mentése és a minták feldolgozása
- Távolítsa el a kanülöket, és nyomja meg a katéterezett helyeket a hemosztázis érdekében a T30 perc után. Figyeljük az állatot, amíg magához tér, és le nem ül. Adjon takarmányt, ha az állat teljesen felépült.
- Közvetlenül ezután minden teljes vérminta K2 EDTA csövekben van jégen. Centrifugáljon 3000 fordulat/perc sebességgel, 4 ° C hőmérsékleten, a gyűjtéstől számított 10 percen belül. A plazma mintákat aliquot részecskékbe töltjük, lefagyasztjuk és -80 ° C-on tároljuk az elemzésig.
- Hagyja a szérumcsőben lévő vért a szokásos szérumkémiai elemzéshez szobahőmérsékleten legalább 20 percig és legfeljebb 30 percig ülni, mielőtt szobahőmérsékleten 3000 fordulat/perc mellett centrifugálna. Fagyassza le a szérummintákat, amíg meg nem vizsgálják, a gyűjtéstől számított 48 órán belül.
MEGJEGYZÉS: A CBC-elemzéshez gyűjtött hűtött teljes vér a Sayed gyűjtésétől számított 24 órán belül.
- Hagyja a szérumcsőben lévő vért a szokásos szérumkémiai elemzéshez szobahőmérsékleten legalább 20 percig és legfeljebb 30 percig ülni, mielőtt szobahőmérsékleten 3000 fordulat/perc mellett centrifugálna. Fagyassza le a szérummintákat, amíg meg nem vizsgálják, a gyűjtéstől számított 48 órán belül.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Az eredmények vannak 1. ábra Az érett, egészséges és diabéteszes cynomolgus makákókból származó demonstratív jellegzetes glükóz- és inzulingörbéket mutatjuk be az IVGTT 30 perc alatt. Egészséges és előrehaladott diabéteszes majmok adatai mutatják, hogy ellentétben állnak az állatok közötti látszólagos különbségekkel a metabolikus jellemzés két szélső végétől. Ezt az IVGTT protokollt a szerzők sikeresen használták hasonló eredménnyel rendelkező rhesus makákókban.
Az egészséges makákó (rhesus és cynomolgus) éheztetett alapszintű glükózszintje akár 50-60 mg/dl 8 is lehet. Amint az ábrán látható, az egészséges NHP kezdeti - a T3-nál mért - glükózkitörése nem emelkedhet olyan magasra, mint egy cukorbeteg állat tipikus kiindulási glükózértéke, amely gyakran meghaladja a 200 mg/dl-t. A következő harminc perc alatt egy egészséges állat glükózszintje gyakran visszatér az alapvonalra, míg a diszmetabolikus és a cukorbeteg állatok nem (1. ábra; folytonos vonalak). Az egészséges állat kísérő inzulingörbéje két csúcsot mutat (Ábra 1; kék szaggatott vonal), amelyek megfelelnek a vércukorszint kezdeti, gyors csökkenésének (1. fázis), amelyet a normálnál nagyobb részben az inzulin perifériás hatásai közvetítenek a glükóz transzportjára és a bevitelre 3, 4. ezeknek a perifériás hatásoknak a mértéke, még az első Az inzulinreakció fázisa, az alacsonyabb szint nem egyenlő a májnak a glükózhoz való hozzájárulásával, amely a kisebb, de tartós második inzulincsúcs (2. fázis) során az endogén glükóztermelés gátlásával befolyásolja a legnagyobb mértékben a glikémiás szinteket.
Amint egy állat egészséges állapotból diszmetabolikussá válik, jellemzően csökken a dextróz bolusra adott inzulinválasz első fázisában, amely csökkent levegő tükröződhet. Azonban a AUC változatlanok maradnak, mivel az inzulintermelés gyakrabban növekszik, ami az eljárás során nagyrészt változatlan glikémiás szintet biztosít, mivel a megnövekedett inzulintermelés kompenzálja az érzékenység csökkenését. Miután egy állat nyíltan cukorbeteg lett, az inzulintermelés drasztikusan visszaesik a szőlőcukor-bolus hatására (1; szaggatott piros vonal). A glikémiás szint az eljárás folyamán továbbra is magas marad, ahogyan a glükóz-clearance is szinte teljes egészében nem inzulinfüggő mechanizmusok révén következik be (1), közvetítik.
| Idő | A Idők (perc) | Valós idő | Vérminta mennyisége (ml) | Próba - példa | Glükózmérő leolvasása (mg/dl) | |
| Alapvonal | 5 ml | 1,5 ml SST - kémia 0,5 ml K2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K 2 EDTA + 50 ul Prot -. Glükóz, inzulin, C-Pep | ||||
| 0 | 30 mp alatt beadott 250 mg/kg intravénás dekstróz infúzió, majd 5 ml heparin sóoldat | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glükóz, Ins, C-Pep | ||||
| 5. | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glükóz, Ins, C-Pep | ||||
| 7. | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glükóz, Ins, C-Pep | ||||
| 10. | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glükóz, Ins, C-Pep | ||||
| 15-én | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glükóz, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glükóz, Ins, C-Pep | ||||
| 30-án | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glükóz, Ins, C-Pep | ||||
asztal 1:. IVGTT eljárási táblázat Megjelenik az IVGTT szabványos eljárási jelentése, amely tartalmazza az eljárás során minden lényeges információt. A dextróz infúziót követő mintaszívások idejét az infúzió végétől kell kiszámítani. Az egyes sorsolásoknál fel kell jegyezni a tényleges időket. Kattintson ide a táblázat letöltéséhez Microsoft Word dokumentumként .
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Az IVGTT az 5., 12., 13. testtömeg alapján értékeli az inzulin glükózstimulált felszabadulásának képességét egyetlen dextróz infúzió útján. A tesztből az éhomi vércukorszint és az inzulinszint érhető el, és lehetővé teszi az állat inzulin- és visszaadja a megnövekedett glükózszintet az alapértékre. Ez információkat nyújt a felhasználó számára az állat normál glükóz- és inzulinszintű egészséges kontrollként, hiperinsulinémiás diszmetabolikus, normoglikémiás vagy hiperglikémiás inzulinrezisztens cukorbeteg állatként történő jellemzésére.
Az IVGTT-ket korlátozza az inzulinérzékenység közvetlen mérésének képessége. Elsősorban az inzulintermelés és a glükóz clearance kiértékelésének módszereként használható. A portális vérellátásból származó máj inzulin extrakció azonban rontja a szisztémás vérellátásból származó "inzulin szekréció" mérését. Ez azonban részben leküzdhető a C-peptid mérésével, amelyet ekvimoláris mennyiségben választ ki a hasnyálmirigy, de a máj nem távolítja el, mielőtt az általános vérellátás bejutna. Ez jobb képet ad az inzulintermelésről a jobb β-sejt funkció értékeléséhez 16. Az IVGTT-k szintén nem tesznek különbséget az inzulinfüggő glükóz-clearance mechanizmusok és az inzulinfüggetlen mechanizmusok között 1, 6. Míg az inzulinérzékenység közvetetten értékelhető az IVGTT-ből származó adatok minimális modellezésével, megbízhatóbb intézkedések érhetők el olyan módszerek alkalmazásával, mint a fokozatos glükóz infúzió (GGI), amely 14 dózis-válasz görbe β sejteket eredményez, 15.
Az inzulinérzékenységet azonban csak közvetett módon értékelik a GGI-vel. Az inzulinérzékenység értékelésének javítása érdekében az IVGTT során szokásos adag inzulint adhatunk be az állatnak, de ez elfedi az endogén inzulintermelést a β-sejtek működésének értékelésének romlásától. A hiperglikémiás és hiperinsulinémiás szorító technikák közvetlenül mérik a glükóz szabályozását az ellenőrzött inzulin expozíció révén. Mind a GGI, mind a szorító technikák hátránya, hogy költséges a kivitelezésük, és több munkaerőt és időt igényelnek (néha az eljárás tervétől függően akár hat-nyolc óra is) a teljesítéshez. Az IVGTT viszont képes egy óra alatt és minimális munkával elvégezhető.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzők aktív kapcsolatban állnak egy szerződéses kutatóintézettel (Crown Bioscience) az anyagcsere-betegségek területén.