Vasfüggő extrahepatikus hepcidin szabályozás - PDF ingyenes letöltés
1 Ulmi Egyetemi Kórház Belgyógyászati Központ Belgyógyászati Klinika I Orvosi igazgató: Prof. Dr. med. Thomas Seufferlein Vasfüggő extrahepatikus hepcidin-szabályozás Értekezés Az Ulmi Egyetem Orvostudományi Karának fogorvosi doktori fokozatának megszerzésére Clara Ruth Frieda Brenig, München, 2013
2 megbízott dékán: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. riporter: PD Dr. Pavel Strnad 2. Előadó: Prof. Dr. Lars Bullinger promóciós napja:
4 Tartalom-jegyzék Tartalom-jegyzék Ábra-lista Táblázatok-lista Rövidítések listája III V VI 1 Bevezetés Vasmérleg Hepcidin expressziója és szerkezete Hepcidin hatásmechanizmusai Hepcidin szabályozása A máj hepcidin szabályozása Hepcidin extrahepatikus szervekben A kutatási munka célja Anyag és módszerek Anyag Vegyszerek Reakcióelegyek és pufferoldatok Készletek Eszközök Módszerek Állattenyésztés Kísérleti beállítások és kísérleti állatok RNS szöveti cdna első szál szintéziséből Kvantitatív valós idejű PCR vasmeghatározás a szövetben Fehérje kivonat a szövetből Fehérje meghatározás Western blot Szövettan és festés Szérum ferritin és szérum vas meghatározás Statisztikai értékelés I
5 Tartalom-jegyzék 3 Eredmények Szérum vas- és szérumferritin-koncentráció alacsony vas- és magas vas-diéták után Az alacsony vas- és magas vas-tartalmú étrend hatása a májra Máj-vas-koncentráció Máj-máj-expresszió Az alacsony vas- és magas vas-tartalmú étrend hatása az extrahepatikus szervekre Az alacsony vas- és magas vas-tartalmú étrend hatása a lépre Alacsony vas- és magas vas-diéták a gyomorban Az alacsony vas- és magas vas-tartalmú étrendek hatása a hasnyálmirigyre Az alacsony vas- és magas vas-tartalmú étrendek hatása a vesékre Az alacsony vas- és magas vas-tartalmú étrend hatása a duodenumra Az alacsony vas- és magas vas-tartalmú étrend hatása a szívre Megbeszélés Szisztémás vas-paraméterek a beadott étrend vaskartalmától függően Helyi vaskoncentráció az extrahepatikus szervekben, a beadott étrend vaskartalmától függően Az extrahepatikus szervek hepcidin-expressziói a beadott étrendtől függően Összefoglaló 53 Ref index 54 Köszönetnyilvánítás 63 Önéletrajz 64 II
8 Táblázatok Táblázatai 1. táblázat: Primer szekvenciák az RT-PCR analízishez 2. táblázat: Vas-standard oldat 3. táblázat: Pipettázási séma a tricin-SDS-poliakrilamid-gél előállításához 22. táblázat: 4. táblázat: Elsődleges antitestek: 5. táblázat: Szekunder antitestek V
9 Rövidítések listája Rövidítések listája µ Micro ALK2/APS AS BMP (R) BPS BSA cdna dest DFO DMT DNS dntp DTT ECL GP 80/H 2 O HAMP Hepc1/HFE HJV IFN-γ IL-6 (R) M n NaCl aktivin receptor-szerű Kináz2/3 ammónium-perszulfát-aminosav-csont morfogenetikus fehérje (receptor) Bathofenantrolinediszulfonsav-dinátrium-só borjúszérum Albumin kiegészítő DNS desztillált desferroxamin-kétértékű fémhordozó Receptor) Moláris Nano-nátrium-klorid VI
10 Rövidítések listája p PCR psmad qrt RNS fordulat/perc SDS SMAD STAT TBS TEMED Tf (R) TGF Tris V Pico polimeráz láncreakció foszforilezett SMAD kvantitatív valós idejű ribonukleinsav fordulatok per perc nátrium-dodekil-szulfát gerinc izom-atrófia és transzplantátumok és transzplantátumok, N, N, N-Tetrametil-etiléndiamin, 1,2-bisz (dimetilamino) -etán transzferrin (receptor) Transzformáló növekedési tényező Tris- (hidroxi-metil) -amino-metán Volt VII
19 1 Bevezetés A szerveket azonban nagyrészt nem tárják fel. Különböző vizsgálatok eddig azt mutatták, hogy különböző tényezők, mint pl A vastúlterhelés, a gyulladás vagy az oxigénhiány befolyásolhatja a nem hepatikus szervek helyi hepcidin-expresszióját, de a mechanizmus általában megmagyarázhatatlan marad. Az extrahepatikus hepcidin-szabályozás megértésének javítása érdekében a jelen kutatási munka elemezte a vas túlterhelésének vagy vashiányának a hatását a vaskimérlegre és a hepcidin expressziójára a különféle szövetekben. Erre a célra vad típusú egereket alkalmaztak modell rendszerként, és különböző vas-étrendekkel etették őket. Ezeknek az étrendeknek a hepcidin expressziójára gyakorolt hatását azután RNS és fehérje szinten megvizsgáltuk. Ezenkívül megmértük a szövetek vaskoncentrációját. 9.
20 2 Anyag és módszerek 2 Anyag és módszer Az ebben a munkában használt összes vegyi anyagot, reagenseket, készleteket, anyagokat és eszközöket a következő felsorolások sorolják fel. 2.1 Anyag Vegyszerek Akrilamid-APS (ammónium-perszulfát) L-aszkorbinsav β-merkaptoetanol Bathofenantrolin-diszulfonsav-dinátrium-só (BPS) Biszakrilamid Szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) Bradford-reagens Bromofenol-kék Coomassie-kék-dezoxinukleotid-trifoszfát-difoszfát-dimetil-deszt Ditiotreitol (DTT) ECL Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Bio Rad, Laboratories Gmbh, München Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Sigma Aldrich Chemie GmbH, Munich Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg BIO-RAD Laboratories GmbH, München Sigma Aldrich Chemie GmbH, München BIO-RAD Laboratories GmbH, München PeqLab, Erlangen MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Nagy-Britannia 10
21 2 Anyag és módszer Iron III nonahidrátot Nitrát vas-karbonát Fejlesztő Eozin Ethanol fixáló oldattal Formaldehid Glicerin Glycine Hematoxiiin izopropanol Kálium-klorid II Nuclear Fast Red metanolt Novex éles Protein oligo (dT) 20-Primer proteázinhibítor Cocktail-tabletták RNeasy Mini Kit RNAlater RT2 SYBR Green/ROX Master Mix SuperScriptIII reverz transzkriptáz Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Tentenal AG & Co KG, Norderstedt Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Tetenal AG & Co KG, Norderstedt Sigma Aldrich Chemie GmbH + München Carl Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Merck, Darmstadt Vector Laboratories, Burlingame, USA Sigma Aldrich Chemie GmbH, Munich Dako Deutschland GmbH, Hamburg Invitrogen, Darmstadt Roche, Mannheim Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Hilden Invitrogen GmbH, Darmstadt 11
22 2 Anyag és módszerek Sósav TEMED (N, N, N, N-Tetrametil-etilén-diamin) Trisz (hidroxi-metil) -amino-metán Tween20 xilol Citromsav-monohidrát VWR International GmbH, Darmstadt Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Sigma Aldrich Chemie GmbH, München Sigma Aldrich Chemie GmbH, München VWR, Ulm Merck KGaA, Darmstadt 12
2 2 Anyag és módszerek Reakciósorok és pufferoldatok Aszkorbinsav Anódpuffer Blot puffer BPS Coomassie Blue solution DNase mix Extraction buffer Munkaoldat vasfestésre Gélbetöltő puffer (ötszörös) 0,088g aszkorbinsav 5ml H 2 O 24,22g Tris ad 1L H 2 O 3,03g Tris 11,26 g glicin 100 ml metanol és 1 liter diszt. H 2 O ph 8,3 14,76 mg BPS 5 ml H 2 O 400 ml metanol 100 ml etánsav 0,4 g Coomassie kék 250G ad 1L dist. H 2 O 70 µl RDD 10 µl DNáz/minta 10 mM Tris 0,5% Triton X-100 ph 7,5 100 ml 2% kálium-hexacianoferrát II 100 ml 1% HCl 1 M Tris 10% SDS 50% glicerin 25% β merkaptoetanol-bróm-fenol-kék 375µl dist. H 2 O ph 6,8 13
24 2 Anyag és módszerek Gélpuffer rakása Katód puffer Standard oldat a vas meghatározásához T40/C3 T40/C6 Tris-pufferolt sóoldat (TBS) Tris-pufferolt sóoldat (TBS) Tris-pufferolt sóoldat Tween (TBST) RLT pufferrel + β ME mesterkeverék a cdna szintézishez I 60, 5g Tris-1L diszt. H 2 O ph 6,8 12,11 g Tris 17,92 g tricin 10 ml SDS ad 1L H 2 O 0,003607g Iron III nitrát nonahidrát 1 ml H 2 O 1811,71g Tris ad 1L dist. H 2 O ph 8,8 7,76 g akrilamid 0,24 g biszakrilamid 20 ml VE-H 2O 18,8 g akrilamid 1,2 g biszakrilamid ad 50 ml VE H 2O 8,76 g NaCl 1,21 g Tris ad 1L dist. H 2 O ph 7,5 1 L TBS 1 ml Tween20 10 µl 1% β merkaptoetanol 1 ml RLT (az RNeasy Mini Kit része) 1 µl Oligo (dT) 20-Primer (0,2 µg/µl) RNS (2 µg) 1 µl dntp-keverék (egyenként 10 mM) ) ad 14 µl RNáz-mentes víz 14
25 2 Anyagok és módszerek Master-Mix a cdna-szintézishez II Master-Mix RT-PCR-hez Primermix citromsav 4µl első szál puffer 1µl 0,1 M DTT 1 µl SuperScriptIII RT (200 U/µl) 5 µl SYBR-Mix 3 µl H 2 O dest . 0,03 µl előreindító (100 µmol) 0,03 µl hátsó láncindító (100 µmol) és 1 µl H20 diszt. 1,05 g citromsav-monohidrát 50 ml H 2 O készletek RNeasy Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden tartalmaz: Első szálú puffer RDD (RNáz-mentes puffer) RNeasy lízis puffer RLT Rnáz-mentes DNase RW1 RPE eszközök 7500 Gyors, valós idejű PCR rendszer Szoftver: Sequence Detection 1.5 verzió, KC4 adatelemző szoftver Analitikai mérleg alkalmazott Biosystems, Darmstadt BioTek, Bad Friedrichshall Sartorius AG, Göttingen 15
A kontroll étrend 3 eredménye alig csökkent (86,9 ± 24 µg/g a vasszegény csoportban, 105,2 ± 22,6 µg/g a kontroll csoportban. Lásd 6. ábra). A vastartalmú csoport májszövetében a vaskoncentráció ötször magasabb volt, mint a kontroll étrendben (589,4 ± 243 µg/g a vasban gazdag csoportban). 5. ábra: Az egerek májának szövettani vizsgálata alacsony vas tartalmú, standard és vasban gazdag étrend után. A berlinkék festéssel színezett májszövet alacsony vas tartalmú táplálékkal ellátott egerek (A) szövetében, standard tápanyagban (B) és (C) -ben vasban gazdag ételeket etettek. Azokban az egerekben, akiket vasdús táplálékkal etettek, jelentős periportális vasfelhalmozódás látható (nyíl). Nagyítás: 20-szoros vaskoncentráció (µg/g) p = 0, EA ST ER 6. ábra: Vaskoncentráció az egerek májszövetében alacsony vas-, standard és vasban gazdag étrend után Vas-koncentráció az egerek májában 5 hét alacsony vastartalom (EA) után, standard ( ST) és 4 hetes vasban gazdag (ER) étrend. Csoportonként legalább 5 egér átlagos értékét mutatjuk be. Máj hepcidin expresszió A vasban szegényen táplált egerek hepcidin1 és hepcidin2 expressziója szignifikánsan csökkent a kontroll étrendhez képest (hepcidin1: p = 0,001; hecidin2: 27
40 3 Eredmények 400 Vas-koncentráció (µg/g) p = 0, p = 0,03 0 EA ST ER 9. ábra: Vas-koncentráció az egerek lépszövetében alacsony vas-, standard és vasban gazdag étrend után Vas-koncentráció az egerek lépében 5 hét alacsony vas-tartalom után (EA), standard (ST) és 4 hetes vasban gazdag (ER) étrend. Csoportonként legalább 5 egér átlagértékét mutatjuk be. AB 6 5 Hepcidin1 expresszió ß-aktinhoz képest p = 0,03 p = 0,05 Hepcidin2 expresszió ß-aktinhoz viszonyítva EA ST ER 0 EA ST ER 10. ábra: Hepcidin mrna expresszió a lépben alacsony vasszintű egerekben, Standard és vasban gazdag étrend (A) Hepcidin1 és (B) Hepcidin2 expresszió a lépben β-aktin expresszióhoz viszonyítva egerekben alacsony vas-diétát (EA), standard étrendet (ST) és vasban gazdag étrendet (ER) követve RT-vel -PCR. Az eredményeket csoportonként legalább 5 egér átlagaként adjuk meg ± szórás. Az értékek relatív értékek, amelyeket a kontrollhoz viszonyítva normalizáltunk (= 1). 30-án
42 3 Eredmények A B C 12. ábra: Az egerek gyomorszövetének szövettani vizsgálata alacsony vas, standard és vasban gazdag étrendben A korpusz berlinkék festése egerekben (A) alacsony vas tartalmú etetés után, (B) a kontroll csoport, (C) a vasban gazdag csoport. A kontroll étrend fő sejtjeiben és a vasban gazdag étrendben példaértékű vas-felhalmozódást nyíllal jelöljük. Nagyítás: 20-szor. tern blot analízist és kvantitatív RT-PCR-t végeztek. A fehérjeelemzés során a STAT3 elleni antitestek és a STAT3 aktív formája, a pstat3 70 kDa-nál sávot mutattak (lásd a 15. ábrát). Az állandó sávintenzitás miatt azonban a vizsgálat nem tárt fel bizonyítékot a megnövekedett STAT3 termelésre. Ezenkívül az IL-6 expressziót kvantitatív RT-PCR alkalmazásával mértük. A rendkívül alacsony expressziós szintek miatt bebizonyosodott, hogy nincs gyulladás (a vasszegény csoportban 2,3 ± 1,6, a kontrollcsoportban 1 ± 0,5, a vasban gazdag csoportban 2,4, lásd a 16. ábrát). 32
43 3 Eredmények 600 vaskoncentráció (µg/g) p = 0,007 0 EA ST ER 13. ábra: Vaskoncentráció változása az egerek korpuszában alacsony vas-, standard és vasban gazdag étrend után Vas-koncentráció az egerek korpuszában 5 hét alacsony vas (EA) után, standard - (ST) és 4 hetes vasban gazdag (ER) étrend. A standard chow-t kapott egerek szolgáltak kontrollként. Csoportonként legalább 5 egér átlagértékét mutatjuk be. AB 20 1,5 Hepcidin1 expresszió ß-aktinhoz képest p = 0,03 Hepcidin2 expresszió ß-aktin 1-hez viszonyítva 0,5 p = 0,04 0 EA ST ER 0 EA ST ER 14. ábra: mrna-expresszió im Alacsony vastartalmú, standard és vasban gazdag étrendet követő egerek korpusza (A) Hepcidin1 és (B) Hepcidin2 expressziója a korpusz β-aktin expressziójához viszonyítva az egerekben alacsony vas tartalmú étrendet (EA), standard étrendet (ST) és magas vas tartalmú étrendet (ER) RT-PCR-rel számszerűsítve. Az eredményeket átlag ± szórásként jelentjük. Az értékek relatív értékek, amelyeket a kontrollhoz viszonyítva normalizáltunk (= 1). 33
44 3 Eredmények alacsony vastartalmú standard magas vas tartalmú máj PosKont pstat3 STAT3 ß-tubulin 15. ábra: A STAT3/pSTAT3 fehérje expressziója egerekben alacsony vas, standard és vasban gazdag étrend után Western blot elemzés az egerek gyomorszövetében alacsony vas tartalmú, standard és vasban gazdag étrend után. Antitestek: pstat3 (foszfoszignális transzduktorok és a transzkripciós fehérje aktivátora), STAT3 (szignál transzduktorok és transzkripciós fehérje aktivátor). A máj PosKont megfelel a máj pozitív kontrolljának. P-tubulint használtunk terhelés kontrollként. 5 IL-6 expresszió a ß-aktinhoz viszonyítva p = 0,01 0 EA ST ER 16. ábra: mrna expresszió az egerek korpuszában alacsony vas, standard és vasban gazdag étrend után Interleukin-6 (IL-6) expresszió a β-aktinhoz képest Az egerekben lévő expresszió alacsony vas tartalmú étrend (EA), standard étrend (ST) és magas vas tartalmú étrend (ER) után, számszerűsítve RT-PCR-rel. Az eredményeket csoportonként legalább 5 egér átlagaként adjuk meg ± szórás. Az értékek relatív értékek, amelyeket a kontrollhoz viszonyítva normalizáltunk (= 1). 34
46 3 Eredmények 25 Vaskoncentráció [! G/g] EA ST ER 18. ábra: Az egerek hasnyálmirigyének vaskoncentrációja alacsony vas-, standard és vasban gazdag étrend után Vaskoncentráció az egerek hasnyálmirigyében 5 hét alacsony vas (EA), standard (ST) és 4 hetes vasban gazdag (ER) étrend. A standard chow-t kapott egerek szolgáltak kontrollként. Csoportonként legalább 5 egér átlagos értékét mutatjuk be. AB 2 2 Hepcidin1 expresszió ß-aktin 1-hez képest Hepcidin2 expresszió ß-aktin 1-hez viszonyítva p = 0,03 0 EA ST ER 0 EA ST ER 19. ábra: Hasnyálmirigy mrna expresszió a vasban szegény, standard és vasban gazdag egerekben Diéta (A) Hepcidin1 és (B) Hepcidin2 expresszió a hasnyálmirigy β-aktin expressziójához viszonyítva egerekben vas-szegény étrendet (EA), standard étrendet (ST) és vasban gazdag étrendet (ER) követően, RT-PCR-rel számszerűsítve. Az eredményeket csoportonként legalább 5 egér átlagaként adjuk meg ± szórás. Az értékek relatív értékek, amelyeket a kontrollhoz viszonyítva normalizáltunk (= 1). 36
48 3 eredmény 300 Vas-koncentráció [! G/g] EA ST ER 21. ábra: Vas-koncentráció az egerek veséjében alacsony vas-, standard és vasban gazdag étrend után Vas-koncentráció az egerek veséiben 5 hét alacsony vas-tartalom (EA) után, standard (ST) ) és 4 hetes vasdús (ER) étrend. A standard chow-t kapott egerek szolgáltak kontrollként. Csoportonként legalább 5 egér átlagértékét mutatjuk be. AB Hepcidin1 expresszió a ß-aktinhoz viszonyítva ) Hepcidin2 expresszió a vesében a β-aktin expresszióhoz viszonyítva, egerekben vashiányos étrendet (EA), standard étrendet (ST) és vasban gazdag étrendet (ER) követően RT-PCR-rel számszerűsítve. Az eredményeket csoportonként legalább 5 egér átlagaként adjuk meg ± szórás. Az értékek relatív értékek, amelyeket a kontrollhoz viszonyítva normalizáltunk (= 1). 38
50 3 eredmény 400 Vas-koncentráció [! G/g] p = 0, EA ST ER 24. ábra: Vas-koncentráció a duodenumban egerekben alacsony vas-, standard és vasban gazdag étrend után Vas-koncentráció az egerek duodenumában 5 hét alacsony vas-tartalom (EA) után, standard (ST) és 4 hetes vasban gazdag (ER) étrend. A standard takarmányt kapott egerek szolgáltak kontrollként. Csoportonként legalább 5 egér átlagértékét mutatjuk be. AB 4 2 Hepcidin1 expresszió a ß-aktinhoz képest Hepcidin2 expresszió a ß-aktin 1 arányához 0 EA ST ER 0 EA ST ER 25. ábra: Hepcidin mrna expresszió a duodenumban egerekben vasszegény, standard és vasban gazdag étrend után (A) Hepcidin1 és (B) Hepcidin2 expresszió a β-aktin expressziójához viszonyítva az egerekben a duodenumban vas-szegény étrendet (EA), standard étrendet (ST) és vasban gazdag étrendet (ER) követően RT-PCR-rel számszerűsítve. Az eredményeket csoportonként legalább 5 egér átlagaként adjuk meg ± szórás. Az értékek relatív értékek, amelyeket a kontrollhoz viszonyítva normalizáltunk (= 1). 40
51 3 Eredmények Az alacsony vas- és magas vas-diéták hatása a szívre Szövettani változásokat vagy vas-felhalmozódásokat a szívben nem találtunk (lásd 26. ábra). A szív vas-koncentrációja a májban lévő vas-koncentráció 10% -ának felel meg. Az alacsony vas tartalmú étrend és a kontroll étrend közötti változások nem láthatók, de a magas vas tartalmú étrendben a koncentráció növekedése hajlamos (8,5 ± 12,0 µg/g az alacsony vas tartalmú csoportban, 3,1 ± 5,7 µg/g a kontroll csoportban, 25,7 ± 22,9 ug/g a vasban gazdag csoportban, lásd a 27. ábrát). Ezenkívül a szív hepcidin expressziós szintje sem mutatott változásokat (Hepcidin1: 1,5 ± 0,8 a vasszegény csoportban, 1 ± 0,7 a kontrollcsoportban, 2,5 ± 1,4 a vasban gazdag csoportban; Hepcidin2: 1,2 A vasszegény csoportban ± 0,3, a kontrollcsoportban 1 ± 0,1, a vasban gazdag csoportban 1,3 ± 0,3). Lásd a 28. ábrát. ABC 26. ábra: Az egerek szívének szövettani vizsgálata alacsony vas-, normál- és vasdús étrend után Berlinkék festés az egerek szívében (A) alacsony vastartalmú etetés, (B) szokásos etetés és (C) vasban gazdag etetés után . Nagyítás: 20-szor. 41